人参二醇促进再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞增殖及调节免疫的作用

摘要

目的：　　观察自行提取分离的人参二醇对免疫介导型再生障碍性贫血（再障）小鼠的疗效，促进再障小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的增殖，及对T淋巴细胞亚群的免疫调节作用。　　方法：　　①全骨髓贴壁法培养骨髓MSC，观察原代细胞和传代细胞形态、增殖状况，及形成成纤维祖细胞集落(CFU-F)的能力。　　②采用成骨细胞、脂肪细胞培养体系，诱导充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化，并分析骨髓MSC细胞免疫表型。　　③将MSC与同种异体小鼠胸腺T淋巴细胞分别按1:25、1:50、1:100比例，共同培养7d，流式细胞术检测各组CD4+、CD8+T淋巴细胞表达的变化。　　④MTT法检测不同浓度人参二醇5、10、25、50、100mg/L体外促进MSC增殖的作用。　　⑤采用免疫介导法建立Babl/c小鼠再障模型，治疗分7组，正常组、模型组、人参二醇低、中、高剂量组，阳性对照复方皂矾丸和环胞菌素A组，均灌胃治疗14d。　　⑥治疗后小鼠的一般情况，计数外周血白细胞、血小板，骨髓病理切片造血组织增生状况。　　⑦再障小鼠骨髓CFU-F集落生成的试验，及人参二醇促进增殖的作用。人参二醇治疗后各组小鼠骨髓细胞形成CFU-F集落的变化。　　⑧治疗后各组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比值的变化。　　结果：　　①培养后MSC原代贴壁细胞形态不均一，可见梭形、圆形、三角形细胞。传代细胞形态趋于均一，以梭形为主，CD44、CD29表达阳性，CD45表达阴性；成骨培养体系诱导14d后茜素红染色可见大量钙化沉淀于胞外基质，成脂培养体系诱导21d后油红“O”染色可见大量橙红色脂肪滴。　　②MSC与同种异体小鼠胸腺 T淋巴细胞共培养， CD4+、CD8+T淋巴细胞均明显低与对照组，提示MSC对CD4+、CD8+T淋巴细胞有抑制。　　③MTT测定显示人参二醇体外具有促进MSC增殖的作用，且呈现剂量-效应依赖关系。　　④再障小鼠外周血的白细胞、血小板数量急剧下降，骨髓病理切片造血细胞减少，造血组织被大量的脂肪组织代替，提示造模是成功的。　　⑤人参二醇治疗5、10、14d，再障小鼠的外周血白细胞、血小板数均显著高于模型组。　　⑥再障模型小鼠骨髓的CFU-F集落数明显低于正常小鼠，而人参二醇各治疗组的CFU-F集落数量均明显高于模型组。　　⑦再障小鼠体内T淋巴细胞亚群比例失调，CD4+/CD8+细胞比例倒置。人参二醇各治疗组能够显著地降低再障异常增高的CD8+细胞数，提高CD4+细胞数，而恢复CD4+/CD8+细胞比值。　　结论：　　人参二醇不但在体外能够有效地促进小鼠骨髓MSC增殖，而且对再障小鼠体内病态造血状态的MSC也同样具有促进增殖作用，从而起到改善造血微环境的作用。人参二醇通过有效刺激骨髓粒系、红系和巨核系三系造血祖细胞增殖，促进再障小鼠的血细胞生成，升高外周血白细胞和血小板数。免疫调节作用是能够显著地降低再障异常增高的CD8+细胞数，提高CD4+细胞数，而恢复CD4+/CD8+细胞比值。人参二醇治疗再障小鼠5d起效，低剂量有效，中、高剂量的作用更为明显，为其临床应用提供客观依据。

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中文摘要

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前言

一、材料和方法

（一）实验室

（二）实验材料

1.动物

2.主要试剂和消耗品

3.仪器设备

（三）实验方法

1.正常小鼠骨髓间充干细胞培养及生物学特性

2.MTT法观察体外人参二醇对MSC的促进增殖作用

3. 人参二醇对再生障碍性贫血小鼠免疫调节的作用

4. 人参二醇促进再障贫血小鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用

（四）统计学处理方法

二、结 果

（一）正常小鼠骨髓间充干细胞生物学特性

1.原代细胞和传代纯化细胞的形态学

2.成纤维集落形成单位(CFU-F)

3.第3和4代MSC的生长曲线

4. 传代后MSC细胞免疫表型分析

5.成骨细胞诱导培养及茜素红染色鉴定

6.成脂细胞诱导培养及油红“O”染色鉴定

7.MSC对同种异体小鼠胸腺T淋巴细胞的调节作用

（二）MTT法观察体外人参二醇促进MSC增殖的作用

（三）人参二醇改善再障小鼠的一般情况及升高外周血白细胞、血小板的作用

1. 改善再障小鼠的一般情况观察

2. 升高外周血白细胞、血小板的作用

（四）流式细胞仪测定各组外周血CD4+、CD8+T细胞

（五） 人参二醇体外促进再障小鼠骨髓间充质干细胞形成CFU-F集落的作用

（六）人参二醇体内治疗后促进再障小鼠骨髓间充质干细胞生成CFU-F集落的作用

（七） 人参二醇改善再障小鼠的骨髓抑制，加快造血功能的恢复的作用

三、讨 论

四、结 论

参考文献

附图

致谢

附：文献综述:中药治疗再生障碍性贫血的机制研究进展