黑曲霉生产柠檬酸工程菌株的构建

目录

声明

摘要

1前言

1．1．1柠檬酸的简介

1．1．2柠檬酸生产的研究进展

1．2黑曲霉的概述

1．2．1黑曲霉的简介

1．2．2黑曲霉的应用

1．3丝状真菌的遗传改造方法

1．3．1原生质体转化法

1．3．2基因枪法

1．3．3限制性内切酶介导转化法

1．3．4电击转化法

1．3．5农杆菌介导转化法

1．4丝状真菌基因敲除及表达

1．4．1丝状真菌基因敲除

1．4．2丝状真菌基因表达简介

1．5丝状真菌筛选标记

1．5．1营养缺陷型筛选标记

1．5．2抗生素抗性筛选标记

1．5．3除草剂抗性筛选标记

1．6．1黑曲霉产柠檬酸机制

1．6．2黑曲霉产柠檬酸条件

1．7．1研究背景与意义

1．7．2本论文研究内容

2材料与方法

2．1实验材料

2．1．1实验所用菌株与质粒

2．1．2主要仪器

2．1．3主要试剂

2．1．4培养基及溶液试剂

2．2实验方法

2．2．1黑曲霉基因组提取

2．2．2大肠杆菌感受态的制备

2．2．3过表达质粒pLH473(pLH454∷pfk)的构建

2．2．4过表达质粒pLH496(pLH454∷fumr)的构建

2．2．7农杆菌介导黑曲霉转化

2．2．8转化子的筛选、验证

2．2．9标记基因HYG的去除

2．2．10摇瓶培养及产物分析

2．2．11黑曲霉RNA的提取

2．2．12黑曲霉酶活的测定

2．2．13菌株生长状态及萌发1青况

3结果与讨论

3．1表达载体的构建

3．1．2fumr表达载体的构建

3．1．3frds表达载体的构建

3．2出发菌株的构建

3．2．1 oahA敲除菌株的构建

3．3过表达菌株构建及筛选

3．3．2fumr过表达菌株的构建和筛选

3．3．3 frds过表达菌株的构建和筛选

3．3．4 mdh过表达菌株的构建和筛选

3．3．5 pyc过表达菌株的构建和筛选

3．3．6 fumr、frds双过表达菌株的构建和筛选

3．4．1过表达菌株菌落生长形态观察

3．4．2过表达菌株萌发状态观察

3．5过表达菌株目的基因转录情况的分析

3．5．2S642、S703、S706过表达菌株表达量分析

3．6过表达菌株的酶活测定

3．7过表达菌株柠檬酸产量分析

4结论

4．1全文总结

4．2论文不足之处

5展望

参考文献

7攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢