柠檬酸工业生产菌株黑曲霉的蛋白质组学研究

摘要

本文对黑曲霉柠檬酸工业高产菌株发酵过程的胞内胞外蛋白质组进行了研究,旨在从蛋白表达的角度阐释柠檬酸高产机理,为菌株改造提供依据。
　　采用实验室5 L发酵罐模拟黑曲霉工业发酵过程,控制溶氧、转速、通气量、pH等参数,并对发酵过程中菌体形态变化、碳源消耗和有机酸分泌等情况进行监测,确定了进行蛋白质组分析的取样点。胞内蛋白取样点为16 h,24 h,40 h,70 h,80 h和96 h;胞外蛋白取样点为24 h,40 h,70 h,96 h。
　　优化黑曲霉蛋白质提取过程,确定胞外蛋白沉淀剂选用含有0.07％β-巯基乙醇,10%TCA的预冷丙酮溶液(-20℃)。胞外蛋白提取缓冲液成分为Tris-HCl pH7.60.1 M,DTT0.1 M,cocktail片/10 mL,SDS1%。胞内蛋白提取缓冲液成分为Tris-HCl pH7.60.1 M,DTT0.1 M,cocktail片/10 mL,SDS4%。优化后的方法提取的蛋白浓度大,纯度高,种类多,为蛋白质组检测分析提供了高品质样品。
　　首次采用iTRAQ标记技术联合LC-MS/MS对黑曲霉柠檬酸工业生产菌株C0827发酵过程细胞内外蛋白质组进行了定量分析。共鉴定出793组胞内蛋白和55组胞外蛋白。柠檬酸合成和积累主要涉及中心碳代谢中糖酵解、三羧酸循环的一部分,相关途径在快速产酸过程中被激活,参与其中的蛋白表达量上调。能量代谢相关蛋白上调。三羧酸循环其余部分、脂类代谢、氨基酸代谢、遗传信息信息处理等途径则有明显下调。柠檬酸大量积累,产酸减缓后,这些途径又重新被激活。其中柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶等表达量变化与产酸过程密切相关,是柠檬酸生产过程的关键。菌体在不同发酵阶段,分泌不同数量和种类的糖苷酶、酯酶和蛋白酶等,以适应不同时期培养基中碳氮源存在形式的差异。
　　蛋白质组实验和发酵胞外产物分析均说明乙醛酸循环的存在。通过在柠檬酸发酵过程不同时间点添加油脂和衣康酸盐探究乙醛酸循环在柠檬酸生产中的作用。发酵前期添加油脂影响呼吸,对菌体生长有一定抑制作用,会造成柠檬酸产量降低。添加油脂没有提高柠檬酸产量或葡萄糖到柠檬酸的转化率。发酵初始添加衣康酸盐抑制乙醛酸循环,不利于菌体生长,但是产酸阶段添加衣康酸盐可以切断柠檬酸经异柠檬酸到乙醛酸的代谢过程,提高了葡萄糖到柠檬酸的转化率。

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第一章 绪论

1.1柠檬酸工业生产

1.2黑曲霉研究现状

1.3蛋白质组研究进展

1.4课题的研究背景及内容

第二章 黑曲霉菌株C0827发酵过程分析

2.1材料和方法

2.2结果

2.3小结

第三章 黑曲霉蛋白质提取方法摸索

3.1材料和方法

3.2结果

3.3小结

第四章 黑曲霉生长阶段胞内蛋白质组学分析

4.1材料和方法

4.2结果

4.3小结

第五章 黑曲霉生长阶段胞外蛋白质组学分析

5.1材料和方法

5.2结果

5.3小结

第六章 乙醛酸循环对柠檬酸高产的作用

6.1已有数据分析

6.2材料和方法

6.3结果

6.4小结

第七章 结论与展望

7.1全文总结

7.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢