基于UHPLC-Q-TOF/MS的中药质量研究方法的建立及其应用

摘要

中医药具有悠久的历史，而中药一味药往往就具有多基原、产地范围广等情况，使同一种中药中的化学成分的种类及含量有所不同；同时在临床中中药多经过炮制加工，且配伍使用，更增加了中药成分的复杂性。以一种或几种指标性成分的含量无法全面的评价中药的质量。色谱指纹图谱的应用为中药质量评价体系开辟了新思路，液相色谱指纹图谱可以从整体表征中药组成及质量，质谱作为检测器可以提供结构信息，推测中药中化合物结构，实现成分快速定性，液相色谱质谱联用技术是中药指纹图谱的重要方法手段，使得研究工作快速高效。多元统计分析可快速区分多个样品差异性，结合中药成分数据库在一定程度上可实现快速、自动化的成分鉴定。本论文以不同产地蒺藜、硫磺熏蒸知母及普洱生茶、熟茶为例，建立一套基于UHPLC-Q-TOF/MS技术结合中药化学成分数据库的快速、简便的中药质量研究方法，并试图在此基础上形成一套具有普适性的中药质量研究方法。　　第一部分　　中药蒺藜为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实。2015版《中国药典》中记载其功效为平肝解郁、活血祛风、明目、止痒。蒺藜不仅在中国有着悠久的临床应用历史，且在全球也应用广泛，但药用领域存在明显差异。欧美地区蒺藜主要用于强壮肌肉、改善性功能；而在国内，蒺藜则以治疗心血管疾病为主。尽管蒺藜广泛分布于全球温带地区，但研究表明欧洲东南部、东亚和南亚产地的蒺藜存在不同的化学型。因此，本课题期望利用UHPLC-Q-TOF/MS结合化学成分数据库通过对北京产地蒺藜的成分研究，建立一套快速的化学成分鉴定方法，并鉴定新疆及罗马不同产地蒺藜化学成分，来阐释蒺藜国内外不同药用领域的差异。　　在课题组前期对蒺藜药材的化学成分分离鉴定的基础上，利用 UHPLC-Q-TOF/MS分析23个甾体皂苷对照品，总结了4种具有代表性甾体皂苷的质谱规律及其色谱规律。在正离子高能量下，替告皂苷元（tigogenin）具有m/z 415、273和255的特征碎片，吉托皂苷元（gitogenin）具有m/z 433、415、289、271和253的特征碎片，海柯皂苷元（hecogenin）的特征碎片为m/z 431、317和299，薯蓣皂苷元（diosgenin）的特征碎片为m/z 415、271和253。在反相C18色谱柱上，当化合物糖链一致，苷元仅为C25位R/S异构时，R构型化合物的色谱保留强于S构型；当化合物苷元一致，糖链仅为末端半乳糖及葡萄糖差异时，连接葡萄糖的化合物色谱保留强于连接半乳糖的化合物。根据总结的北京产地蒺藜化学成分的质谱裂解规律，得到其母核特征碎片m/z 449、431、417和415；中性丢失碎片m/z 144、142、114和112。结合前期总结得到的蒺藜化学成分数据库，建立一套基于液质联用技术及化学成分数据库的快速识别体系，共鉴定北京产地蒺藜91个化学成分，包括82个甾体皂苷及9个黄酮类成分。并将其运用于新疆及罗马产地蒺藜的化学成分鉴定中，成功鉴定其中共137个化学成分，同时在罗马产地蒺藜中发现一类具有人参皂苷母核的三萜皂苷类化合物共10个。　　第二部分　　中药知母为百合科多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge．的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴润燥等功效。由于知母根茎中高达30%的多糖总量，使得其储存困难。硫熏法因其价格低廉、操作简便仍被用于新鲜知母药材的前期加工中。尽管2015年版《中国药典》附录收载了中药材及饮片中SO2残留量测定方法，但因药材中二氧化硫含量会随着贮藏时间的延长不断逸失。因此，本课题希望利用液质联用技术建立一种快速筛查硫磺熏蒸知母的方法。　　知母经硫磺熏蒸制备成含硫知母饮片，利用UPLC-Q-TOF-MSE结合数据库、主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），分析并在线鉴定了硫磺熏蒸前后知母饮片中的16个主要的差异性成分，其中9个主要存在于硫熏知母饮片中；确定了熏蒸后知母饮片中的化学标志物，为硫熏后新产生的亚硫酸酯化衍生物。同时利用UPLC-Q-TOF/MSE寻找主要化学标志物——知母皂苷BII亚硫酸酯（m/z 983）的手段，建立了知母饮片硫磺熏蒸的快速筛查方法，该方法便捷准确，可作为知母质量控制的有效辅助手段。　　第三部分　　普洱茶是以云南大叶种茶树Camellia sinensis (Linn.) var.assamiea (Masters) Kitmaura树叶为原料加工而成。普洱茶不仅口感独特，更具有多种保健功效。根据是否经过发酵，可将普洱茶分为生茶和熟茶。在渥堆发酵过程中，普洱茶的内在化学成分发生了显著性变化，儿茶素、茶红素等成分减少，而茶褐素含量升高。由于物质基础的改变，生熟普洱茶的药理作用也有所不同。普洱生茶性凉，有清热、解毒等功效；而普洱熟茶的降脂、降糖等功效则更加显著。　　普洱茶中化学成分种类多样，主要包括黄酮、酚酸、生物碱、多糖等多种成分。本章旨在对普洱茶中化学成分的研究，验证数据库结合液质联用技术的快速鉴定方法的普适性。利用 UPLC-Q-TOF/MSE结合已建立的茶叶化学成分数据库，对生熟普洱茶中化学成分进行分析，鉴定了普洱生茶中44个化学成分，普洱熟茶中35个化学成分，利用多元统计的分析方法，分析普洱茶发酵前后的化学成分变化，并鉴定了其中 26 个差异性成分。通过对普洱生、熟茶的研究发现，发酵过程不仅引起儿茶素类成分含量的降低，同时在普洱熟茶中检测到黄烷-3-醇的C-8位取代产物的生成。　　结论：　　1、本论文通过对北京产地蒺藜化学成分的研究，得到一种基于液相质谱联用技术结合中药化学成分数据库的快速鉴定方法，该方法利用中性丢失碎片可快速表征化学成分的糖基碎片；利用质谱裂解得到的特征碎片快速寻找具有同类型母核的成分，结合总结的数据库快速进行表征及结构鉴定。该方法成功应用于新疆及罗马产地的蒺藜，显示了该方法的合理性。　　2、硫磺熏蒸知母的研究中，不仅运用液相质谱联用技术结合化学成分数据库的手段，更运用了多元统计分析，将多样本进行合理聚类，突出分类后的样品特征，降低了数据处理的重复性，有效提高分析人员的工作效率。通过液相质谱联用技术结合数据库及多元统计分析快速表征及鉴定了硫磺熏蒸后知母药材的差异性成分，确定及鉴定了硫磺熏蒸知母的化学标志物。　　3、液相质谱联用技术结合数据库及多元统计分析的快速鉴定方法不仅可以鉴定以皂苷为主要成分的中药材，更可分析鉴定中药中黄酮、生物碱、酚酸等多种成分。利用UPLC-Q-TOF/MS结合中药数据库以及多元统计分析鉴定了生、熟普洱茶中的化学成分并快速表征分析了发酵后的差异性成分，使这一方法在更多类型的成分鉴定中得到应用。　　本课题利用超高效液相（UPLC）的高分离性能分离中药中的成分，表征化合物组成；利用飞行时间质谱（Q-TOF/MS）的鉴定功能对其中的成分进行定性鉴别，从而了解中药的成分组成以及一定程度上的相对量的关系；结合已建立的中药数据库实现快速、自动的成分鉴定；通过数理统计方法，例如PCA、OPLS-DA可以比较不同样品间成分的异同，从而解决相应的质量相关问题，以此形成一种具有一定普适性的表征鉴定中药成分的质量分析方法，解决质量相关的问题。

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