基于定量多色荧光原位杂交技术的卵巢癌多基因拷贝数异常的研究

摘要

卵巢癌死亡率高居妇科肿瘤的首位，治疗策略为肿瘤减灭手术联合以铂类药物为基础的化学治疗。近年来虽然患者生存率有所提高，但约有80-85％的卵巢癌患者会复发，并对化疗药物如顺铂产生耐受，五年生存率徘徊于30-40%。随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即非整倍体和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形成和发展密切相关。然而针对卵巢癌相关的多基因拷贝数变化研究尚处于起步阶段。定量多基因荧光原位杂交技术，简称QM-FISH(Quantitative Multi-gene Fluorescencein situ Hybridization)，QM-FISH技术关键在于基因组合探针设计、探针制备、标本制备和分子杂交条件的优化。相较于传统的FISH技术信噪比提高了5-10倍，可以在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因(目前可同时定量20余个基因)，且可以自由组合目的基因。该技术是寻找和确认肿瘤临床标本的特异性等位基因失衡极其有效的工具，可以用于大规模研究临床肿瘤标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)。此外QM-FISH对确定肿瘤细胞耐药亚群、疾病进展时的克隆演变和识别肿瘤干细胞也有显著的作用。本研究首次将QM-FISH技术应用于卵巢癌的研究，以发现进展期上皮性卵巢癌多基因拷贝数异常变化的规律。　　随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即非整倍体和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形成和发展密切相关。包括比较基因组杂交等的卵巢癌基因组异常相关研究发现包括MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1等一系列重要基因在卵巢癌的发生发展中起重要作用。因此我们在研究中设计了包括该五个基因的探针组合，对合成探针所用BAC克隆进行了鉴定，并使用外周血单个核细胞对探针进行了验证。该研究将用合成的探针应用于卵巢癌标本的研究，结果发现图像清晰，能够获得满意的荧光信号强度和荧光信号强度／背景信号比值，信号分裂率低。由于临床标本种类较多，本研究进一步将QM-FISH技术应用于卵巢癌的多种标本类型包括石蜡切片、冰冻切片、组织印片和细胞甩片，对各种标本进行对比并制定出相应的标本选择策略。显示出在各种标本都能获得的情况下，应该首选使用冰冻切片，其次选用石蜡切片。在给予手术治疗的患者中则应选择组织印片标本。腹水阳性的进展期卵巢癌患者无论病人手术与否都可直接使用腹水肿瘤细胞标本甩片后进行FISH检测。　　研究的第二部分应用自制的荧光标记探针，分别在10名复发性进展期上皮性卵巢癌患者的腹水肿瘤细胞标本中检测了MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1共计5个基因的拷贝数异常。结果发现70%的病例中出现了MYC扩增，40%的患者中发生了RB1缺失现象。针对出现频率较高的MYC扩增和RB1缺失，将研究范围扩大至58例上皮性卵巢癌患者，通过进一步研究发现在近三分之一的患者中同时出现了这两种染色体异常。在卵巢癌石蜡切片的免疫组化和腹水细胞的Western结果印证了MYC扩增造成蛋白表达水平上升。结合临床病理资料和术后随访，研究发现在FIGO III-IV期上皮性卵巢癌中RB1基因缺失明显增加，低分化-未分化组的RB1基因缺失率较高分化-中分化组明显增加。研究同时发现RB1基因缺失的患者生存期较不存在RB1基因缺失的患者显著缩短。对比典型的复发性上皮性卵巢癌患者初诊时和复发后的定量多色原位基因杂交结果，观察到克隆演化现象的发生。复发后，亚克隆“4MYC1RB”的比例由初诊时的11.00%上升至27.59%，同时伴有2个亚克隆的新生。该研究提示RB1基因缺失可以作为指导卵巢癌分期和预测疾病预后的指标之一。　　根据前两部分研究工作结果，我们申请《一种检测上皮性卵巢癌的基因探针组合物及试剂盒（201310106080.4）》获得国家专利授权。该专利技术提供了一种检测上皮性卵巢癌的基因探针组合物，包括MYC基因探针、RB1基因探针、CHEK2基因探针、TP53基因探针和BRCA1基因探针，该技术可对上皮性卵巢癌同一样本甚至上皮性卵巢癌单个肿瘤细胞同时进行5基因的检测。该试剂盒可以用于确定上皮性卵巢癌的分子病理类型，判断病情预后，指导个体化治疗，评估临床治疗效果，监测病灶复发和转移。　　卵巢癌干细胞，与该肿瘤发生、进展、复发、耐药、常见种植转移等现象密切相关。因此本研究的第三部分利用流式细胞术分选腹水肿瘤细胞中ALDH阳性亚群富集卵巢癌干细胞，对ALDH阳性细胞使用卵巢癌干细胞培养体系进行培养可获得成球细胞，经流式细胞术和免疫荧光染色鉴定成球细胞具有卵巢癌干细胞表型。定量多色原位基因杂交显示，在复发性卵巢癌患者腹水肿瘤干细胞与肿瘤细胞相比，亚克隆数较少，且染色体变异程度较低。MYC出现了不同程度的拷贝数增加。发现1例患者在不同的亚克隆中分别出现BRCA1、TP53、CHEK2、RB1缺失的多种组合。　　由于在上皮性卵巢癌干细胞水平确认了MYC和RB1的染色体异常，本研究的第四部分进一步扩大研究范围，利用芯片数据，对比上皮性卵巢癌干细胞和肿瘤细胞的表达谱，筛选出若干肿瘤干细胞水平特异的表达谱变化。对其信号通路的分析发现，ErbB通路往往出现整体异常。以这些异常表达基因为基础，在CMAP数据库中筛选出18种已知的小分子药物。其中某些小分子已经在其他肿瘤中展现出治疗效果，部分克服了肿瘤细胞的抗药性，这些小分子有望在卵巢癌治疗中发挥作用。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 建立使用QM-FISH技术研究卵巢癌的方法

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

第二部分 以QM-FISH技术为基础的卵巢癌肿瘤细胞多基因拷贝数异常的研究

2.1 对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三部分 卵巢癌干细胞的分离鉴定及多基因拷贝数异常的研究

3.1 对象和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四部分 卵巢癌干细胞基因表达谱分析和小分子药物筛选

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:荧光原位杂交技术在生物标记物研究和个体化医学中的应用

致谢