O抗原重组减毒沙门菌对O1、O2和O78禽致病性大肠杆菌的免疫保护研究

摘要

禽致病性大肠杆菌(APEC)O1、O2和O78是许多地区田间感染中分离率最高的血清型。已知针对O抗原多糖的特异性免疫应答可以对APEC提供免疫保护，目前尚无有效的通过O抗原多糖来预防APEC感染的疫苗。因此本研究的主要目的是通过构建O抗原重组减毒沙门菌以提供对APEC三种血清型的免疫保护。主要内容和结果如下:　　1.组装O抗原多糖的酵母-原核穿梭质粒的构建　　使用PCR扩增含有酵母复制及筛选元件的片段ARS4/CEN5-TRP-Spec和原核复制及筛选元件的片段ori-asd-T1T2，在Gibson重组酶作用下实现重组，获得用于组装DNA长片段的、含有不同原核复制起点的酵母-原核穿梭质粒pSS25、pSS26、pG8R210和pG8R211。　　2.编码APEC O1、O2和O78的O抗原基因簇组装　　将大小分别为10.9kb、15.9kb、13.2kb、26.9kb、29.1kb和40.1kb的APEC O1、O2和O78O抗原以及融合的APEC O1+O2、O2+O78和O1+O2+O78O抗原经酵母转化介导的重组法(TAR)组装入pSS26穿梭质粒，获得表达不同APEC O抗原的重组质粒pSS27、pSS28、pG8R206、pG8R207、pG8R208和pG8R209，实现对APEC O1、O2和O78的O抗原基因簇的组装。　　3.递送APEC O抗原的鼠伤寒沙门菌缺失株的构建　　使用自杀质粒介导的重组法对鼠伤寒沙门菌的asd、crp、cya、rfbP基因进行突变，分别获得S184(Δasd-66)、S185(Δasd-66ΔrfbP45)、S739（Δasd-66Δc rp-24Δcya-25）和S740(Δasd-66Δcrp-24Δcya-25ΔrfbP45)突变株。　　4.表达APEC O抗原的重组鼠伤寒沙门菌的生物学特性分析　　将表达APEC O1、O2和O78O抗原的重组质粒pSS27、pSS28和pG8R206电转化入S740(Δasd-66Δcrp-24Δcya-25ΔrfbP45)后，血清凝集、银染、Western-Blot、结晶紫染色和热凝集检测结果显示APEC O抗原成功转入减毒沙门菌中。稳定性检测结果显示在3天、间隔12h的五次传代中，S740(pSS27)、S740(pSS28)和x12441（pG8R206）菌株的稳定率高达85％;生物学特性分析显示APEC O抗原的表达对减毒沙门菌S740的生长、黏附、入侵、多黏菌素B和DOC敏感性均没有显著影响;将重组质粒pSS27、pSS28电转化入S184(Δasd-66)、S185(Δasd-66ΔrfbP45)后发现其毒力降低100倍以上。　　5.表达APEC O1、O2和O78O抗原的减毒沙门菌免疫原性研究　　以罗曼蛋鸡为研究模型，分别使用口服、肌肉注射两种免疫途径，气囊和肌肉注射两种攻毒途径对重组菌株S739(pSS27)和S740(pSS27)的免疫保护效果进行分析。结果显示使用S740递送APEC O1O抗原比使用S739递送能产生更好的免疫保护;肌肉注射免疫途径与口服免疫途径相比，能产生较强的体液免疫和较弱的粘膜免疫，口服免疫则反之;气囊攻毒较肌肉注射能更严谨地评估疫苗保护效果。其中口服免疫气囊攻毒的S740(pSS27)的攻毒保护率为66.7％。口服免疫气囊接种的S740(pSS28)的攻毒保护率为71.4％。使用口服免疫气囊接种的方式对重组菌株x12441(pG8R206)对同源APEC O78的攻毒保护率为95％，对异源APEC O1和O2的攻毒保护率分别为10％和40％。　　6.表达APEC O1和O2O抗原减毒沙门菌的联合免疫　　通过口服-肌肉注射的异源免疫方式对S740(pSS27)和S740(pSS28)进行了联合免疫。结果显示，联合免疫组可以同时诱导对APEC O1和O2LPS的免疫应答并提供相应的攻毒保护，保护效果分别为66.67％和73.33％。　　7.O抗原长度对沙门递送载体生物学特性和免疫原性的影响　　通过自杀质粒介导的重组法构建沙门菌Δwzz缺失株及互补株，获得了表达长、中、短长度不等的O抗原的鼠伤寒沙门菌S741、S742、S743、S744、S745、S746、S747、S748、S749和S750。动物免疫保护结果显示，表达15-21个O单元时，沙门菌的免疫原性最强，可以诱导较高的免疫应答。　　综上，构建O抗原重组减毒沙门菌可以实现对APEC O1、O2和O78的免疫保护，通过调节O抗原长度可优化沙门菌递送载体的免疫原性。

目录

声明

摘要

英文缩写词汇

第一章文献综述

1禽大肠杆菌病

2 O抗原多糖

3．1减毒沙门菌简介

3．2减毒沙门菌作为疫苗递送载体的优势

3．3 Asd+平衡致死系统在抗原递送中的应用

3．4减毒沙门菌载体在多糖疫苗中的应用

4无缝克隆

4．1 Gibson组装

4．2酵母同源重组技术

4．3展望

5选题目的及意义

第二章组装O抗原多糖的酵母-原核穿梭质粒的构建

1试验材料

1．1菌株、质粒

1．2主要试剂及配置

1．3主要仪器设备

2试验方法

2．1引物设计

2．2含有不同复制起点的穿梭质粒的构建

3结果

3．1重组质粒构建策略

3．2重组质粒PCR鉴定

4讨论

第三章编码APEC O1、O2和078 O抗原基因簇的组装

1试验材料

1．1菌株、质粒

1．2主要试剂及配置

1．2主要仪器设备

2．1 APEC O抗原结构和基因簇分析

2．2引物设计

2．3 APEC O抗原基因簇克隆

2．4 APEC O抗原基因簇组装

2．5 Gibson重组和TAR重组法之组装效率对比

3．1 APEC O抗原结构

3．2 APEC O抗原基因簇扩增

3．3 APEC O抗原组装

3．4 Gibson和TAR的组装效率对比

4讨论

第四章递送APEC O抗原的沙门菌缺失株的构建

1试验材料

1．1菌株、载体

1．2主要试剂及配置

1．3主要仪器设备

2试验方法

2．1缺失株构建

2．2重组质粒向缺失株中转化

2．3重组沙门菌的鉴定

2．4质粒在沙门菌中的稳定性检测

3结果

3．1 S．Typhimurium缺失株的PCR鉴定

3．2表达APEC O抗原的重组沙门菌的PCR鉴定

3．3血清凝集试验

3．4银染与Western-Blot鉴定

3．5 O抗原重组减毒沙门菌的稳定性检

4讨论

第五章表达APEC O抗原的重组沙门菌的生物学特性分析

1试验材料

1．1菌株、载体、细胞

1．2主要试剂及配置

1．3主要仪器设备

2试验方法

2．1种子液制备

2．2生长曲线测定

2．3细菌表型鉴定

2．4运动性检测

2．5多黏菌素B和DOC敏感性检测

2．6细胞黏附入侵试验

2．7 P22噬菌体敏感性检测

2．8小鼠和蛋鸡体内的定殖能力分析

2．9小鼠中的半数致死量检测

3结果

3．1生长曲线测定

3．2细菌表型鉴定

3．3多黏菌素B和DOC敏感性分析

3．4 P22噬菌体敏感性检测

3．5细胞黏附入侵能力检测

3．6定殖和LD50检测

4讨论

第六章表达APEC O1、O2和O78 O抗原的减毒沙门菌免疫原性研究

1试验材料

1．1菌株、动物

1．2主要试剂及配置

1．3主要仪器设备

2试验方法

2．1攻毒保护试验

2．2样品采集与处理

2．3抗体水平检测

2．4免疫保护率测定

2．5免疫途径和攻毒途径对免疫保护效果的评估

3结果

3．1 LPS提取效果检测

3．2免疫途径和递送载体对免疫应答的影响

3．3S740(pSS28)诱导的免疫应答

3．4 χ12441(pG8R206)诱导的同源和异源免疫应答的比较

3．5免疫途径和递送载体对免疫保护效果的影响

3．6S740(pSS28)诱导的免疫保护

3．7 χ12441(pG8R206)对同源和异源的攻毒保护

4讨论

第七章表达APEC O1、O2 O抗原的减毒沙门菌联合免疫

1试验材料

1．1菌株、动物

1．2主要试剂及配置

1．3仪器设备

2．1菌株准备

2．2雏鸡准备

2．3免疫程序及分组

2．4样品采集与处理

2．5抗体水平检测

2．6免疫保护率测定

2．7补体介导的血清杀菌试验

2．8抗体介导的细胞吞噬试验

2．9病理切片分析

3结果

3．1抗体水平检测

3．2攻毒保护存活率

3．3免疫血清功能分析

3．4病理切片分析

4讨论

第八章O抗原长度对沙门递送载体生物学特性和免疫原性的影响

1材料方法

1．1菌株、质粒及动物

1．2主要试剂及配置

1．3仪器设备

2试验方法

2．2 wzz缺失株的脂多糖图谱分析

2．3不同培养条件对O抗原长度的影响

2．4 P22噬菌体敏感性检测

2．5 MIC检测

2．6细胞膜通透性检测

2．7小鼠体内定殖能力检测

2．9攻毒保护试验

2．10样品采集

2．11抗体浓度检测

2．12补体介导的血清杀菌作用

2．13补体沉积试验

3结果

3．2不同培养条件对细菌O抗原长度的影响

3．3 MIC、噬菌体及补体敏感性检测

3．4细胞膜通透性检测

3．5小鼠体内定殖能力检测

3．6减毒的wzz缺失株LPS图谱分析

3．7免疫保护效果

3．8 LPS特异性抗体检测

3．9免疫血清介导的补体沉降和血清杀菌能力检测

4讨论

全文总结

创新点

参考文献

致谢

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