表达大肠杆菌外膜蛋白抗原的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究

摘要

鸡大肠杆菌病(Chicken Colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenicEscherichia coli，APEC)引起的传染病，感染该病会造成鸡体局部或全身性感染并引起一系列疾病最终导致死亡，该病已成为危害养禽业的重要疫病之一。鸡大肠杆菌病的防控和治疗以药物和疫苗为主，抗菌药物仍是主要防治措施。但随着人们对抗菌药物越来越广泛的使用，大肠杆菌的耐药性、药物残留等问题日趋突出，近些年来，由于这些问题抗生素的使用遭到了广泛的置疑和反对。预防该病最有效的方法是接种疫苗，采取疫苗预防与合理用药相结合的措施是最为有效的方法。因此开发具有交叉保护的广谱疫苗是防控本病的重中之重。本研究选择减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R株为宿主菌，以asd基因作为营养缺陷标志，以编码大肠杆菌外膜蛋白的S632基因为外源基因，构建减毒鸡伤寒沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统表达大肠杆菌外膜蛋白抗原，以探讨该重组口服疫苗对预防禽致病性大肠杆菌的保护效果。
　　1.大肠杆菌外膜蛋白基因S632的克隆与原核表达
　　本研究根据GenBank发表的大肠杆菌外膜蛋白的主要编码基因S632序列，采用DNAStar序列分析软件对比分析，针对S632设计一对引物。以江苏省42株疑似大肠杆菌的临床分离株为模板，PCR扩增目的片段S632，将目的片段克隆至pMD19-T simple vector，而后转化大肠杆菌DH5α，经筛选鉴定后对其进行测序并对结果进行分析。发现其中有28株菌为大肠杆菌，测序结果表明，S632在大肠杆菌中普遍存在且高度保守。将已构建的重组质粒pET-42a-S632转化BL21(DE3)进行诱导培养，当以终浓度为1.0 mM IPTG诱导4h时表达量最高，检测到分子量大约为63 KDa的目的蛋白。通过SDS-PAGE分析，该融合蛋白为包涵体，通过尿素变性、复性及镍柱亲和层析纯化的方法，最终获得浓度为0.964mg/ml的纯化融合蛋白，命名为pS632。该蛋白可作为包被抗原，为后续ELISA实验检测特异性抗体提供了材料。
　　2.表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究
　　利用PCR技术扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白的基因S632，将其插入含有asd基因的表达载体pYA3342中，构建重组表达载体pYA3342-S632，再将重组质粒电转化至已缺失编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9RΔasd突变株中，构建重组减毒鸡伤寒沙门氏菌活疫苗SG9R（pYA3342-S632）。并对重组菌的生长特性、口服安全性等生物学特性进行评定。将重组菌SG9R（pYA3342-S632）、SG9R(pYA3342)接种20日龄非免疫SPF鸡，分别作为免疫组及载体对照组，同时以PBS组为空白对照组。分别采集各组免疫鸡免疫后不同时间段血清，利用间接ELISA法测定其体内特异性IgG抗体动态水平，首次免疫14d后，重组疫苗菌免疫组血清IgG抗体水平明显高于空载体对照组和PBS空白对照组(P＜0.05)，差异显著;而空载体对照组与PBS空白对照组之间无显著性差异(P＞0.05)。在二免两周后收集并制备气管粘膜液样品和肠粘膜液样品，利用间接ELISA法测定其体内特异性sIgA抗体水平，SG9R（pYA3342-S632）免疫组可在鸡的十二指肠粘膜中检测到特异性sIgA抗体。免疫后，每组每周随机抽取3只试验鸡，分离外周血淋巴细胞，利用流式细胞术(FCM)监测每组鸡外周血中CD3+和CD8+T淋巴细胞动态变化。结果显示，免疫后外周血中CD3+T细胞及CD8+T细胞含量均呈逐渐增加的趋势，各时期含量均高于PBS对照组，在二次免疫一周后达到较高水平随后保持平稳。用禽致病性大肠杆菌强毒株QD2(O78∶H54)分别对各实验组进行后胸气囊攻毒，观察10d内，重组疫苗菌免疫组、空载体对照组及空白对照组的死亡率分别为20.0％、70.0％和80.0％。用肠炎沙门氏菌50336菌株进行攻毒，PBS空白对照组的死亡率高达90％，重组疫苗菌免疫组和空载体对照组死亡率分别为60％和70％。上述结果显示，重组疫苗对禽致病性大肠杆菌具有较好的免疫保护效果。

目录

摘要

符号说明

文献综述

一、染色体-质粒平衡致死系统研究进展

1．1 营养缺陷标志基因的选择

1．2 染色体-质粒平衡致死系统的构建

1．3 染色体-质粒平衡致死系统在疫苗中的应用

二、鸡大肠杆菌外膜蛋白研究进展

2．1 外膜蛋白的组成、结构及其功能

2．2 外膜蛋白的致病作用

2．3 外膜蛋白的免疫原性

三、研究的目的与意义

参考文献

研究一 大肠杆菌外膜蛋白基因S632的克隆与原核表达

1 材料

1．1 病料来源

1．2 菌株、载体

1．3 培养基和主要试剂

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 临床分离鉴定大肠杆菌及S632基因目的片段的扩增

2．2 pMD19-T-S632重组质粒的构建

2．3 S632基因的表达及SDS-PAGE分析

2．4 重组蛋白的大量诱导表达及表达后的处理

3 结果

3．1 病原菌的分离培养

3．2 PCR扩增分离株大肠杆菌的S632基因

3．3 重组质粒pMD18-T-S632的测序鉴定

3．4 重组质粒pET-42a-S632转化BL21的PCR鉴定

3．5 融合蛋白诱导表达及纯化

4 讨论

参考文献

研究二 表达大肠杆菌共同外膜蛋白抗原的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌构建及免疫效果研究

1 材料

1．1 菌株与质粒

1．2 主要试剂

1．3 试验动物

2 方法

2．1 重组菌SG9R(pYA3342-S632)的构建

2．2 口服疫苗的生长曲线测定

2．3 接种菌液的制备及活菌数的测定

2．4 重组菌对仔鸡的安全性试验

2．5 重组口服疫苗对鸡的免疫保护试验

2．6 重组口服疫苗对鸡的细胞免疫的影响

2．7 血清中特异性抗体IgG检测

2．8 粘膜特异性抗体sIgA检测

2．9 攻毒试验

3 结果

3．1 PCR扩增目的基因

3．2 重组表达质粒pYA3342-S632的构建与鉴定

3．3 生长试验

3．4 口服重组疫苗的安全性

3．5 外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞动态变化检测

3．6 免疫鸡血清中IgG抗体检测结果

3．7 特异性sIgA抗体检测结果

3．8 免疫鸡体增重结果

3．9 仔鸡免疫重组口服活疫苗攻毒保护结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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