秸秆发酵制取生化腐殖酸过程中的理化特性及微生物学特性研究

摘要

我国的秸秆资源十分丰富，常规方法是将秸秆发酵作为有机肥，利用秸秆发酵制取生化腐殖酸，既可减少环境污染，又可得到高附加值的生化腐殖酸产品，从而提高秸秆资源化利用率。本研究探讨了稻草段+尿素、稻草粉+尿素、稻草段+牛粪、稻草粉+牛粪四种处理在发酵过程中的理化性质、秸秆组分化、腐殖质形成和微生物类群特征，取得了以下结果。　　发酵过程中，4种处理的理化性质发生了系列变化。堆料颜色逐渐由黄色或黄棕色转化成棕黑色；发酵最高温度达74℃，高温阶段(≥55℃)持续了25d;发酵料pH呈现出先降低再升高的趋势，发酵结束后物料pH为7.92-8.08。　　各处理中温和高温微生物数量细菌>放线菌>真菌。发酵结束后，中温细菌数量介于1.10×109～1.32×109cfu?g-1，中温放线菌数量介于l.lO×106—1.22×106cfu.g'I;中温真菌数量介于4.33×103～5.64×103cfu?g-1之间。各处理的高温细菌数量介于2.99×108～4.6x108cfu?g-1，高温放线菌数量介于7.81×105～8.21×105cfu.g-1。而发酵初期，物料中未能检测到高温真菌；至第30d，各处理高温真菌数量达到最高，介于1.25×104～1.52×104cfu?g-1，至发酵结束(60d)，高温真菌数量介于2.47x103～5.OO×103cfu?g-1。　　不同处理的纤维素、半纤维素和木质素含量随发酵时间延长而降低。其中，纤维素含量由初始值29.61%～31.gg%降至1.24～1.96%，半纤维素含量从初期的24.16%～27.74%降至后期的5.97%～6.42%。木质素含量略有减少，由初始的25.28%～25.93%降低至24.76%～25.11%。　　水溶性组分含量表现为先增加后降低，由初期4.3%～9.8%增加至17.5%～18.1%，随后降至9.8%～10.9%。发酵料的C／N由初始的31.7～32.8下降至13.9～14.7。腐殖质含量由初始的55.6g?kg-1～81.3g?kg-1增加到117.3g?kg-1～125.8g?kg-1。富里酸含量由初期的38.2g?kg-1～41.3g?kg-1降低至29.9g.kg-1～33.4g.kg-1;而胡敏酸含量由12.7g-kg-1～34.4g?kg-1增加至81.3g-kg-1～85.8g-kg-1，发酵料的H/F由0.31～0.83增加到2.49～2.70。　　对4个处理的腐熟期样品细菌群落进行了DGGE-PCR分析，结果表明，处理Ⅰ和Ⅱ的条带数为22，处理Ⅲ和Ⅳ的条带数为20;对DGGE图谱进行多样性指数分析，结果显示，处理I和II细菌丰度和多样性指数高于处理in和IV。对DGGE条带克隆测序，结果表明，样品中的细菌主要有苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、未可培养屈挠杆菌科（UnculturedFlexibacteraceaebacterium），其余为未培养菌（Unculturedbacterium）。这些菌属于y变形菌门(γ-proteobacteria)，α变形菌门(a-proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。　　采用454焦磷酸测序对添加尿素和牛粪的两种秸秆发酵样品（处理Ⅰ对应S1;处理Ⅳ对应S2）的细菌类群进行了分析，结果表明，在门、纲、目、科、属的分类水平上，两个样品的细菌群落结构和优势菌群不同。主要集中在变形杆菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）；S1和S2的变形杆菌门类群比例分别为31.62%和35.81%，拟杆菌门比例分别占27.41%和35.2g%。此外，S1中厚壁菌门（Firmicutes）占18.15%，unclassifiedBacteria占8.80%，柔膜菌门(Tenericutes)占7.28%，其他门占6.74%；而在S2中，厚壁菌门(Firmicutes)占3.43%，unclassifiedBacteria数量占9.63%，浮霉菌门(Planctomycetes)占7.06%,其他门的细菌占8.78%。　　在属的分类水平，在≥1%比例上，S1中有17个属，S2有13个属。样品S1主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、无胆甾原体属(Acholeplasma)、Alkaliflexus、Sulfurimonas、Petrimonas、Serprns、Tissierella、Sedimentibacter、密螺旋体属(Treponema)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、Sphingopyxis、Saccharofermentans、梭菌属(Clostridium)、螺旋体属（Spirochaeta）、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、Luteimonas、Pusillimonas，S2中主要奄Acholeplasma、Alkaliflexus、Sphingopyxis、Devosia、Methylobacillus、Steroidobacter、Aequorivita、Arenibacter、Rhodopirellula、Vitellibacter、Lysobacter、Crocinitomix、Blastopirellua。在≥1%比例上，仅Acholeplasma、Alkaliflexus、Sphingopyxis三个属为两个样品共有的类群。在两处理样品中，top10的OTUs中没有共同的单元，说明发酵料添加牛粪和尿素对细菌类群影响大，导致优势类群完全不同。　　本研究结果表明，应用不同外加氮源，秸秆发酵形成生化腐殖酸过程中，尽管发酵温度等参数、秸秆降解率、腐解物中的腐殖质含量及其组分不存在显著差异，但微生物类群显著不同，且添加尿素的秸秆发酵物料细菌类群多样性高于添加牛粪的处理，说明在不同环境中，参与腐殖酸形成与转化的微生物群落呈现多样化。

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