生姜秸秆沼气化资源循环利用潜力及沼气发酵微生物学特性研究

摘要

发展循环农业是现代农业的重要内容。我国是生姜种植大国，每年要产生的新鲜生姜秸秆，利用生姜秸秆发酵制取沼气是有效利用生姜秸秆的途径之一。本文以生姜秸秆为原料，在常温25℃条件下进行沼气发酵，分别测定了沼气产气量，沼气组分，沼液养分含量，以及发酵过程中生姜秸秆中纤维素、半纤维素和木质素含量变化;同时采用PCR-DGGE和代表性条带克隆测序及运用IIIuminaMiseq测序技术，揭示了生姜秸秆沼气发酵不同阶段细菌和古菌群落结构变化。结论如下:
　　(1)在室温条件下，添加10％新鲜生姜秸秆，沼气发酵产气分为两个阶段，第一阶段从第6d开始产气，至第42d结束，第二阶段从第63d开始产气，至第121d结束，平均产气率为803 mL/g TS。发酵过程中pH保持在正常范围，沼气中甲烷最高含量达55.6％，符合国家沼气工程运行管理规范的规定。
　　(2)对沼气发酵不同时段生姜秸秆纤维素、半纤维素、木质素含量进行了分析，结果表明，新鲜生姜秸秆的纤维素、半纤维素、木质素含量分别为32.96％，22.03％和7.5％，至发酵结束时，沼气发酵残留物中纤维素，半纤维素和木质素含量分别是13.76％，8.06％和58.58％，纤维素和半纤维素含量下降，而木质素含量相对增加。
　　(3)采用PCR-DGGE技术分析了不同时段生姜秸秆沼气发酵中细菌群落结构多样性，从6个DGGE条带中选取了36根代表性条带克隆测序，这些条带代表的细菌类群与参与硫代谢的海洋底栖细菌、海洋环境中的厌氧细菌、谷物厌氧消化产沼气的细菌类群相近。
　　(4)运用IIIumina Miseq测序技术分析了不同发酵时段沼液样品S1(0d)，S2(42d)和S3(121d)的细菌和古菌群落结构多样性。对3个样本的细菌类群进行分析，分别获得了24833、29068和26557条序列。在97％相似度水平下共得到6692个OTUs，样品S1、S2和S3共有OTU数为601个;S1和S2，S1和S3，S2和S3的相同OTU数分别为992个，769个和1141个;在纲水平上，S1优势细菌是Bacteroidia(24.12％)，Clostridia(20.59％)，Beta proteobacteria(15.13％)，S2优势细菌是Bacteroidia(46.89％)，Clostridia(21.41％)，Epsilon proteobacteria(13.5％);S3优势细菌是Bacteroidia(67.73％)，Clostridia(16.2％)。
　　对3个样本古菌测序后，分别获得了47119、55952和54375条古菌序列。在97％相似度水平下共得到3820个OTUs，S1、S2、S3共有OTU数为822个,S1和S2，S1和S3，S2和S3的相同OTU数分别为1042个，991个和1165个。在属水平，S1优势古菌绝大多数是未分类古菌，S2优势菌属有甲烷袋状菌属（Methanoculleus），占7.93％，甲烷粒菌属（Methanocorpusculum），占4.33％，甲烷杆菌属（Methanobacterium），占4.06％;样品S3优势菌属有甲烷袋状菌属（Methanoculleus），占3.21％，甲烷杆菌属（Methanobacterium）占2.42％。
　　(5)盆栽试验中，3个处理间生姜株高和鲜姜重量差异达到显著水平。化肥+沼液处理，生姜的株高最大，鲜姜最重，分别为133±10.44cm和71±1.31g。化肥+沼液处理比单施化肥株高增加了52.8％，鲜姜重量增加了18.3％，达到了显著差异水平。

目录

声明

摘要

1．文献综述

1．1 引言

1．2 沼气发酵的研究

1．2．1 沼气发酵过程

1．2．2 沼气发酵条件控制

1．2．3 沼液在沼气发酵中的应用

1．3 沼气发酵微生物多样性研究

1．3．1 传统的微生物研究方法

1．3．2 PCR-DGGE技术

1．3．3 宏基因组学技术研究

1．5 本研究的意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 发酵原料

2．1．2 接种物

2．2 研究方法

2．2．1 新鲜生姜秸秆秸秆发酵

2．2．2 生姜秸秆发酵沼气产生量及发酵前后生姜秸秆组分变化

2．2．3 沼气组分测定

2．2．4 生姜秸秆沼气发酵过程中细菌类群的PCR-DOGE分析

2．2．5 新鲜生姜秸秆沼气发酵过程中细菌和古菌群落多样性的高通量测序

2．2．6 数据处理

3．结果与分析

3．1 生姜秸秆发酵沼气产生情况

3．1．1 新鲜生姜秸秆沼气产生特点

3．1．2 沼气组分变化

3．2 不同发酵时间点沼液理化性质分析

3．2．1 沼液pH变化

3．2．2 沼液中全氮、全磷、全钾含量变化

3．2．3 生姜秸秆发酵残渣中组分变化

3．3 不同发酵时间点沼液细菌类群的PCR-DGGE分析

3．3．1 扩增16S rDNA片段

3．3．2 沼液细菌DGGE指纹图谱及多样性指数分析

3．4 细菌PCR-DGGE优势条带序列分析

3．5 高通量测序分析发酵液细菌和古菌类群变化

3．5．1 细菌群落多样性分析

3．5．2 古菌群落多样性分析

3．6 生姜秸秆沼液盆栽生姜实验结果

3．6．1 盆栽试验生姜株高和生姜重量

3．6．2 生姜土壤理化特性分析

4．讨论

4．1 生姜秸秆发酵沼气产生情况

4．2 生姜秸秆发酵环境变化情况

4．3 不同时间点发酵液细菌的PCR-DGGE分析

4．4 不同时间点Miseq测序发酵液中细菌及古菌群落多样性分析

4．5 沼液种植生姜试验

5．全文结论

参考文献

致谢