日本血吸虫肝期童虫cDNA文库的构建及其磷酸丙糖转移酶基因的表达、鉴定

摘要

为寻找有效的疫苗候选分子和早期的诊断日本血吸虫病的试剂,我们用日本血吸虫阳性钉螺逸出尾蚴,人工感染家兔,感染15天后剖杀家兔,门静脉灌注法收集肝期童虫约100mg,酚氯仿法提取童虫总RNA约30mg,以PolvT为引物,在MMLV RnaseH<'->反转录酶的作用下,逆转录合成cDNA,再利用MMLV酶的末端转移酶特性PCR合成cDNA双链.引物中含有sfi A,B酶切位点.经过纯化、酶切、过柱片段大小分离后,与λTriplEx2噬菌体载体两臂连接包装后形成日本血吸虫童虫的cDNA文库.初始文库的容量为3.6×10<'6>,重组子经感染XL-Blue菌后扩增后文库的滴度达10<'10>pfu/ml.任意挑取克隆经自身环化后提取质粒,酶切后片段大小范围为400-1200bp,以急性血吸虫病人阳性混合血清筛选此文库,共获得20个阳性克隆,阳性克隆经过测序和同源性序列比较,发现是其中之一是血吸虫磷酸丙糖转移酶的基因,将其亚克隆入真核表达载体pBK-CMV中,IPTG诱导表达后SDS-PAGE分析,所表达的蛋白质为32kDa,用阳性病人血清经预吸收后作Western-blot反应呈阳性.该试验成功地构建了日本血吸虫肝期童虫cDNA文库,所获血吸虫磷酸丙糖转移酶基因有望作为疫苗候选分子和早期诊断试剂,有值得进一步深入研究的价值.

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

个人简历

致谢

中英文词对照表