人TRAIL基因的克隆、表达纯化及对人A549细胞的抗肿瘤作用及其部分机制

摘要

本实验选择了人肺腺癌A549细胞瘤株作为我们实验研究的对象，通过TRAIL对人肺腺癌A549细胞诱导凋亡研究，在A549的荷瘤裸鼠的动物模型上研究了其体内的抗肿瘤活性，并进一步研究了TRAIL与化疗药物放线菌素D(actinomycinD，ActD)、紫杉醇(泰素，Taxol)和顺铂(cisplatin，CDDP)的联合作用对人肺腺癌A549细胞的体外协同抗肿瘤活性，通过化疗药物协同增强TRAIL抗肿瘤活性作用机制的初步研究，为降低临床化疗药的用药量，减轻其对机体的不良反应提供一定的理论基础。 本文通过电镜观察到TRAIL蛋白在体外诱导A549肿瘤细胞凋亡过程中细胞核的典型凋亡特征。揭示了化疗药物ActD、Taxol和cisplatin在亚细胞毒性浓度下能明显协同增强TRAIL对A549肿瘤细胞的细胞毒性作用。提示这种协同凋亡作用可能主要通过细胞内的诱导凋亡因子来介导。剖析了TRAIL能明显地降低荷瘤A549裸鼠肿瘤的发生率，并抑制其生长的特性。

目录

论文说明：英文缩写对照表、资助

第一部分：人TRAIL基因的克隆表达及其纯化工艺的研究

1前言

2实验材料

2.1试剂

2.2仪器

3实验方法

3.1PCR反应引物的配制

3.2PCR扩增反应及流程

3.3琼脂糖凝胶电泳

3.4PCR产物的纯化

3.5小样质粒的抽提纯化

3.6DNA及质粒的酶切反应

3.7外源DNA片段与质粒的连接

3.8琼脂糖电泳DNA片段的回收

3.9大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化

3.10工程菌pET-11a-TRAIL/BL21的诱导表达

3.12SDS聚丙烯酰胺凝胶的染色及脱色

3.13发酵罐规模的发酵

3.14细菌的裂解和包涵体的制备

3.15包涵体的溶解和复性

3.16复性后样品的浓缩和目标产物的纯化

3.17纯度鉴定——蛋白质的银染

3.18纯度鉴定——HPLC

3.19TRAIL蛋白鉴别实验——Westernblotting

3.20Lowry蛋白含量测定

3.21重组人TRAIL蛋白的活性检测

4结果

4.1全长人TRAILcDNA的PCR扩增反应

4.2全长人TRAILcDNA的克隆和酶切分析

4.3全长人TRAILcDNA的序列分析

4.4可溶型人TRAIL（114-281 amino acid)基因的PCR扩增反应

4.5可溶型人TRAILcDNA的克隆和酶切反应

4.6可溶型人TRAILcDNA的序列分析

4.7重组表达质粒pET-11a-TRAIL（114-281)的构建

4.8基因工程菌pET-11a-TRAIL（114-281)/BL21（DE3）的诱导表达

4.9工程菌pET-11a-TRAIL（114-281)/BL21（DE3）的发酵

4.10发酵菌体的裂解和包涵体的（Inclusion Bodies,IBs）的纯化

4.11包涵体的变性、复性及复性液的浓缩

4.12重组可溶性人TRAIL的纯化

4.13目标蛋白的鉴别实验-Westernblotting

4.14重组可溶性人TRAIL的纯度检测

4.15重组可溶性人TRAIL的N-端15个氨基酸的序列分析

4.16重组可溶性人TRAIL的活性检测

5讨论

5.1TRAIL选择性的诱导肿瘤细胞凋亡作用

5.2人TRAIL基因的克隆表达

5.3基因工程菌pET-11a-sTRAIL/BL21（DE3）的发酵及其纯化工艺的摸索和建立

5.4重组人TRAIL活性检测的建立

5.5重组人TRAIL主要质控指标的建立

6小结

7.参考文献

第二部分：TRAIL抗肿瘤作用及其部分机制

1.前言

2实验材料

2.1试剂

2.2仪器

3实验方法

3.1A549细胞培养及体外抗肿瘤活性

3.2流式细胞仪检测重组人sTRAIL体外的抗肿瘤活性

3.3透射电镜检测重组人sTRAIL对肿瘤细胞A549的诱导凋亡作用

3.4化疗药物与重组人sTRAIL体外协同抗肿瘤活性

3.5各组抑制率的计算

3.6western印迹实验的细胞裂解样品的制备

3.7Lowry蛋白定量

3.812％SDS-PAGE

3.9Western印迹实验

3.10A549细胞的培养及细胞悬液的制备

3.11肿瘤发生率抑制实验

3.12肿瘤形成后的荷瘤裸鼠的体内抑制肿瘤生长实验

3.4统计学处理

4.结果

4.1sTRAIL对人肺癌A549细胞的体外抗肿瘤活性的浓度——效应关系

4.2sTRAIL对人肺癌A549细胞的体外抗肿瘤活性的时间——效应关系

4.3sTRAIL作用于人肺癌A549细胞的透射电镜观察实验

4.4化疗药物与sTRAIL协同作用于人肺癌A549细胞

4.5A549细胞死亡受体（DR4和DR5）和假受体（DcR1和DcR2）的表达

4.6sTRAIL和sTRAIL/cisplatin对荷瘤裸鼠肿瘤发生率的影响

4.7sTRAIL和sTRAIL/cisplatin抑制荷瘤裸鼠新生肿瘤生长的抑制曲线

4.8sTRAIL和sTRAIL/cisplatin对荷瘤裸鼠新生肿瘤生长抑制结果

4.9肿瘤形成后的荷瘤裸鼠模型的体内抗肿瘤作用

5.讨论

5.1TRAIL体外抗肿瘤活性的研究

5.2TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡作用

5.3ActD、Taxol和cisplatin与TRAIL的协同抗肿瘤活性研究

5.4 Act D、Taxol和cisplatin与TRAIL的协同诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制及对A549细胞膜表面死亡受体和假受体的表达影响

5.5sTRAIL对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠肿瘤发生率的影响

5.6sTRAIL/cisplatin对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠的协同抗肿瘤作用

5.7 sTRAIL对人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠动物模型的体内抗肿瘤效应与剂量之间的关系

6.小结

7.参考文献

本研究的创新点

整体研究示意图

个人简历

致谢

文献综述细胞凋亡及其TRAIL诱导肿瘤细胞的研究进展

摘要

前言

一、细胞调亡

二、死亡受体介导的细胞调亡通路

三、TRAIL的诱导肿瘤细胞调亡与临床

参考文献