花药的主要功能是产生有功能的花粉以及成熟花粉的及时释放。模式植物拟南芥的花药四层体细胞壁包括表皮层、药室内壁、中层和绒毡层。其中，绒毡层作为花药壁的最内层，与花粉形成密切相关，为发育中的小孢子提供营养、胼胝质酶，以及花粉外壁物质等；而药室内壁与花粉的释放相关。近几年，克隆了多个绒毡层发育的关键基因，但是对绒毡层基因的精细调控网络仍不清楚。中层介于药室内壁和绒毡层之间，对其发育和基因表达了解非常有限。 本文运用激光显微切割技术分别特异地收集拟南芥花药四分体时期前后的绒毡层细胞，抽提RNA，质检合格后反转录成cDNA，接着进行转录组测序。98％的Reads可以比对到拟南芥参考基因组，几乎全部富集在参考基因组的C D S元件上。早晚期的绒毡层细胞中分别有18298和18227个的基因表达。早期绒毡层细胞中显著表达的基因，主要参与RNA转录调控，蛋白翻译与修饰，各种酶类的合成以及细胞发育过程等；晚期绒毡层细胞中显著表达的基因，则主要参与蛋白降解，信号转导，糖类等的转运以及细胞壁的降解等。已知绒毡层发育的遗传调控通路DYT1-TDF1-AMS-MS188，将这四个转录因子突变体的芯片数据与绒毡层细胞的转录组数据进行综合分析。分析发现，dyt1突变体下有1548个基因在绒毡层中表达，dytl，,tdf1共同下调的基因1354个，dyt1, tdf1, ans共同下调的基因985个，有810个基因在dyt1, tdf1, ans, ms188中均下调。将在dyti下调但不在tdf1下调的基因定义为Dm特异调控的基因，以此类推，Dm特异调控的基因有194个，TDF1、AMS和MS188特异调控的基因分别有369、175和810个。DYT1参与绒毡层的早期发育；TDF1继续调节绒毡层的发育，并为绒毡层的PCD作准备；AMS启动花粉壁的形成和绒毡层的PCD; MSi88主要调控绒毡层细胞壁的降解和花粉壁的形成。激素可能参与到特定阶段的绒毡层发育。生长素是D Y T时期的主要激素，乙烯信号转导基因在TDF1阶段明显富集，生长素和脱落酸相关基因在MS188阶段富集。DYT1 TDF1、AMS这三个绒毡层发育早期的转录因子分别调节一些特定的E3泛素连接酶，从而通过泛素化蛋白降解途径去降解一些蛋白质。综上，DYT1-TDF1-AMS-MS188这条遗传通路以及各转录因子调节的下游基因共同形成了复杂的绒毡层基因调控网络。 本研究利用激光显微切割技术收集百合中层细胞并进行转录组测序。共获得了207792808条Reads，拼接后得到65029条Unigene。将所获得的Unigene与NR、SWISSPROT、KOG、GO和K E G G这5个公共数据库进行比对，结果发现，分别有27156，21367，17654，8828，19784条Unigene可比对到以上数据库中。已注释的Unigene比对到N R数据库中的主要物种为水稻和玉米；与K O G数据库比对后按功能共分为24类，主要为一般性的功能预测，转录后调控，信号转导，细胞运输和分泌与囊泡运输；经过与K E G G数据库比对后按照代谢通路可分为211类，有46.68%与代谢本身相关，其余与遗传信息处理、环境信息交互处理、细胞进程相关；根据G?功能可分为3大类64小类，主要包含细胞和膜的细胞组分，具有结合和催化活性的分子功能，参与代谢、细胞和调控生物学过程。综合基因功能注释结果，拟南芥中层细胞中表达的基因有4763个，包括尺 EMS, BAMi, BAM2, SERKi, SERK2, ROXY, TDFi这些与绒毡层分化和发育相关的基因。中层细胞的转录组信息为今后进行中层细胞特异的分子标记的开发和关键基因的克隆及功能分析等研究提供基础数据。通过凝胶迀移阻滞实验体外证明A M S可以直接结合于bHLH089启动子上，但是染色质免疫共沉淀实验体内并不能证明A M S能结合到bHLH010,089,091的启动子上，同时烟草瞬时表达系统表明，bHLH010,089,091的启动子在烟草体系中能被启动，并不适用烟草瞬时表达实验。然而，Rescue实验获得ams变体背景的ProAMS:bHLH010,089,091转基因株系不能恢复各自的表达，也不能恢复ams的突变表型。这些结果表明，在绒毡层、小孢子和中层中均有表达的三个功能冗余的bHLH转录因子BHLH101,089,091与AMS之间并不是简单的上下游调控关系，可能存在蛋白互作和反馈调节。
展开▼
