拟南芥绒毡层转录因子TDF1与MS188功能差异性的研究

摘要

在植物研究中，雄性育性是研究植物生殖发育的重要内容，花药作为雄配子体发生的重要场所，包含了非常复杂的雄配子体发育过程，因此对花药及花粉发育的机理机制研究有重要的理论意义。制备雄性不育系用于杂交育种获得杂种优势是现代遗传育种的重要手段，所以控制植物雄性生殖发育对于农业生产有着重要的应用价值。在花药发育过程中，绒毡层对于植物花粉发育有着重要的作用，给小孢子提供营养以及必需物质。随着分子生物学的发展与研究的深入，人们克隆了一些与绒毡层发育相关的转录因子，但对这些基因的具体功能特性尚未有很全面的认识。 在本文中，我们重点对拟南芥绒毡层相关转录因子调控通路上的两个MYB家族转录因子MS188与TDF1在结构功能以及相似性上进行了分析。两者在蛋白序列的N端部分存在比较高的保守性，通过N端与C端互换后植株表型分析，我们发现MS188能够行使TDF1的部分功能，而TDF1则需要加入MS188物种之间高度保守的44AA才能行使部分MS188功能。通过GFP亚细胞定位，我们发现这44AA影响MS188核定位功能，并用烟草激活表达系统验证了44AA对于激活下游的影响，通过体外结合实验EMSA确定了TDF1与MS188在R2R3功能域上存在冗余。这些结果表明，MS188与TDF1同为MYB家族转录因子在功能与分子机制上存在差异性，但在部分功能域上又存在一定的保守性。 综上所述，本文的结果表明TDF1与MS188同作为花药发育转录调控通路上的MYB家族关键转录因子，两者虽然在部分功能域上存在功能冗余，但是分别调控了不同的下游因子来控制拟南芥绒毡层的发育及小孢子的成熟。这些分子机理的阐明加深了我们对绒毡层细胞如何调控花粉发育这个生物学问题的了解。

目录

第1章 引 言

1.1 花药发育

1.1.1 花药与花粉发育过程

1.1.2 绒毡层发育及功能

1.2 雄性不育与绒毡层相关转录因子研究进展

1.2.1 雄性不育原理

1.2.2绒毡层相关转录因子与雄性不育

1.3 调控通路中MYB转录因子研究进展

1.3.1 MYB家族转录因子的分类

1.3.2 TDF1研究进展

1.3.3 MS188研究进展

第2章 材料方法

2.1 材料

2.1.1 植株

2.1.2 菌株

2.1.3 质粒

2.2 仪器

2.3 试剂、抗生素

2.4分子生物学实验方法

2.4.1拟南芥种植培养

2.4.2 CTAB法提取植物总DNA

2.4.3 植物总 RNA 提取

2.4.4 植物总 RNA 纯化

2.4.5 RNA反转录体系

2.4.6 目的基因片段的PCR扩增

2.4.7RT-PCR与Real Time PCR

2.4.8 DNA胶回收

2.4.9目的DNA片段与pEasy-Blunt Simple载体连接

2.4.10 PCR鉴定菌落阳性克隆

2.4.11 大肠杆菌质粒的提取

2.4.12 双酶切反应体系

2.4.13 T4连接体系

2.4.14质粒载体转大肠杆菌

2.4.15 农杆菌感受态的制备和转化

2.4.16转基因植株的转化

2.4.17烟草瞬时激活Luciferase（LUC）实验

2.5 细胞学实验方法

2.5.1 亚历山大染色

2.5.2 半薄切片

2.6 生物化学实验

2.6.1 MBP蛋白的体外表达和纯化

2.6.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.6.3凝胶迁移(EMSA)方法步骤

2.6.4凝胶迁移(EMSA)方法步骤

2.6.5蛋白亚细胞定位

2.6.6酵母双杂交方法步骤

2.7 实验涉及引物序列和软件

第3章 结果

3.1 拟南芥绒毡层相关转录因子MS188与TDF1保守性分析

3.2 TDF1与MS188互换全长互补植株

3.3 TDF1与MS188部分置换后补入相应突变体

3.4 TDF1与MS188交叉互换后下游基因表达分析

3.5 MS188与TDF1功能结构域分析

第4章 讨论

4.1 TDF1与MS188序列存在保守性且功能存在差异性

4.2 关键44AA序列直接影响MS188转录因子蛋白功能

4.3 TDF1与MS188调控下游机制存在差异

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

声明