5'端突变人干扰素-α2b基因在大肠杆菌BL21中的高效表达

摘要

目的：定点突变人干扰素-α2b(hIFN-α2b)基因的5’端序列，构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核高表达载体pJW2-rhIFN-α2b'，转化至大肠杆菌DH5α，BL21，Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞，分析不同宿主菌对其表达量的影响，经SDS-PAGE，Western blot鉴定获得重组人干扰素-α2b的高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b'/BL21。
　　 方法：依据大肠杆菌密码子偏好性，在不改变hIFN-α2b的氨基酸序列的情况下，定点突变hIFN-α2b基因5’端序列并PCR扩增出rhIFN-α2b'，克隆至pUC19，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝-白斑筛选及测序验证正确，将rhIFN-α2b'克隆至温控型表达载体pJW2，NdeⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR验证正确后，分别将pJW2-rhIFN-α2b和pJW2-rhIFN-α2b'转化至大肠杆菌DH5α，BL21，Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞，30℃过夜培养，42℃温度诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析宿主菌DH5α，BL21，Rosetta-gami B(DE3)对目的蛋白表达的影响进而选择大肠杆菌BL21为其宿主菌；挑取pJW2-rhIFN-α2b'/BL21单菌落，30℃过夜培养，42℃温度诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE，Western blot鉴定分析并以WISH细胞-VSV病毒系统的细胞病变抑制法（CPE）测定表达蛋白的抗病毒活性及其效价。
　　 结果：NdeⅠ/BamHⅠ双酶切、PCR验证及测序结果证实pJW2-rhIFN-α2b'构建成功；SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b'(BL21)比pJW2-rhIFN-α2b'(DH5α)，pJW2-rhIFN-α2b'(Rosetta-gami B(DE3))的hIFN-α2b表达量高；SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b'/BL21表达的rhIFN-α2b约占菌体总蛋白23.6％，Western blot表明rhIFN-α2b具有与hIFN-α2b相同的免疫原性，纯化的rhIFN-α2b经WISH细胞-VSV病毒系统证实其比活性达1.2×108 IU/mg。
　　 结论：成功构建出5’端突变的rhIFN-α2b原核高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b'(BL21)，可提高其在大肠杆菌中的表达水平。