人工合成的干扰素α－2b基因在大肠杆菌中的高效表达

摘要

本发明设计合成了在大肠杆菌中高效表达的基因序列,构建了高效表达质粒pHX－hIFNα－2b、人干扰素α－2b大肠杆菌生产菌,具有很高的生产价值,可用于多种药物制剂及其它产品的生产。

说明书

基因工程人工干扰素α-2b(rhIFNα-2b)对多种病毒感染有较好的疗效，甚至对某些肿瘤，特别是血癌，也有治疗效果。如能降低生产成本，大量提供廉价的rhIFNα-2b药品，将会产生很高的社会效益和经济效益。

本发明提供了一个比以前更好的rhIFNα-2b表达系统。它是通过选用大肠杆菌偏爱的密码子，并用计算机模拟计算了翻译起始区和干扰素α-2b基因5′二级结构的最小生成自由能，综合考虑了上述两个因素，设计并合成了人干扰素α-2b基因序列，将其装入高效表达载体pLy4，构建成pHX-hIFNα-2b表达质粒。构建所得的基因工程干扰素生产菌是一个能高效表达人基因工程干扰素α-2b系统，具有很高工业化生产价值，将用于生产人干扰素α-2b注射液和人干扰素α-2b应用胶囊等制剂的药物生产。

本发明的特征是在于设计了人干扰素α-2b在大肠杆菌表达的基因序列，并进行人工合成，构建了人干扰素α-2b的表达质粒pHX-hIFNα-2b，构建了人干扰素α-2b大肠杆菌生产菌，并进行了人干扰素α-2b的高效表达，表达量达菌体总蛋白的30％左右，具有很高的生产价值。并证明工程菌是稳定的。

本发明是通过的下述实施例进行实施：

发明中的附图说明：

图1、人工合成hIFNα-2b基因DNA顺序

图2、FI、FII、FIII片段的拼接及克隆

图3、hIFNα-2b基因中片段PCR合成电泳图

     M：pGEM DNA Marker

图4、M13mp18-F II·F III的构建

图5、M13mp18-F I·F II·F III的构建

图6、PUC18-hIFNα-2b

图7-1基因测序5′→

图7-2基因测序3′→

图8、pHX-hIFNα-2b表达质粒的构建

图9、pHX-hIFNα-2b质粒酶切鉴定图

      1.λ/Hind III+EcoR I

      2.质粒

      3.EcoR I

      4.Bg1 II

      5.EcoR I/BgL II

      6.EcoR I/Sal I

图10、pHX-IFNα-2b 50代次酶切图

      1.λ/Hind III Marker

      2.pHX-hIFNα-2b第10代酶切图谱

      3.pHX-hIFNα-2b第20代酶切图谱

      4.pHX-hIFNα-2b第30代酶切图谱

      5.pHX-hIFNα-2b第40代酶切图谱

      6.pHX-hIFNα-2b第50代酶切图谱

      7.λ/Hind III Marker

图11、pHX-hIFNα-2b 50代次蛋白质表达SDS-PAGE电泳图

      M：SDS-PAGE低分子量标准蛋白

      1.pHX-hIFNα-2b第10代次蛋白质表达

      2.pHX-hIFNα-2b第20代次蛋白质表达

      3.pHX-hIFNα-2b第30代次蛋白质表达

      40.pHX-hIFNα-2b第40代次蛋白质表达

      50.pHX-hIFNα-2b第50代次蛋白质表达

      培养条件：M9培养基、30℃过夜、42℃诱导。

实施例1  表达基因合成

本发明选用了大肠杆菌偏爱的密码子，并用计算机模拟计算了翻译起始区和IFNα-2b基因5′端二级结构最小生成自由能，综合考虑上述两个因素设计了全合成人干扰素α-2b(hIFNα-2b)基因序列(见图1-1和图1-2)及合成组装路线。

1、小片段合成将hIFNα-2b基因的正、负两链分解成16个依序部份重叠的小片段，分别用DNA合成仪进行合成。

2、中片段拼接合成的16个小片段按顺序分成三组，分别经PCR连接成三个中片段(F_I、F_II、F_III)，长度分别为：F_I-200bp、F_II-100pb、F_III220bp，它们各自的末端均含酶切位点：F_I(EcoR I/Bgl II.Bam H I)，F_II(Bam H I.Bgl II/Hind III)，F_III(Hind III/Sal I)。分别按各自的末端酶切位点酶切，并克隆到M13mp18或M13mp19中，测定DNA顺序，从中筛选出含正确序列的M13mp18-F_I，M13mp19-F_II和M13mp18-F_III。中片段的拼接简程(见图2)。PCR电泳图鉴定(见图3)。

3、M13mp18.F_II.F_III的构建用Hind III和Pvu I分别酶切M13mp19-F_II.和M13mp18-F_III，将切出的F_II片段与酶切的M13mp18-F_III连接，克隆，用BamH1和Sall酶切、筛选，得到M13mp18-F_II.F_III.构建简程(见图4)。

4、M13mp18F_I.F_II.F_III的构建  用Bam h I和Sal I酶切M13mp18-F_II.F_III得到F_II.F_III片段，与经同样酶切的M13mp18-F_I相连接、克隆，用EcoR I和Sal I酶切筛选，得到M13mp18-F_I.F_II.F_III构建简程(见图5)。

5、PUC18-hIFNα-2b的构建用EcoR I和Sal I酶切M13mp18-F_I.F_II.F_III，所得F_I.F_II.F_III片段与经同样酶切的PUC18相连接。得到PUC18F_I.F_II.F_III。该质粒用Bgl II酶切，再连接，即得到PUC18-hIFNα-2b(见图6)。DNA测序确证人工合成hIFNα-2b基因与设计相符，编码正确(见图7-1、图7-2、图1-1和图1-2)。

实施例2 pHX-HIFNα-2b表达质粒的构建

高效表达载体pLY4由刘新垣教授实验室提供，这是刘新垣教授实验室构建的一个温度诱导型高表达载体。详细构建资料参阅《中国科学》(B辑)，1995，25(10)：1063-1070。用EcoR I和Sal I从PUC18-hIFNα-2b中切出hIFNα-2b基因克隆到pLY4中，得到表达质粒pHX-hIFNα-2b(见图8)。该质粒在大肠杆菌中高效表达，表达水平可达菌体总蛋白的30％左右。质粒大小及酶切鉴定图(见图9)。

实施例3干扰素α-2b生产菌的构建

1、宿主菌：大肠杆图DH5α

2、质粒pHX-hIFNα-2b的转化：

从新鲜的大肠杆DH5αLB平板挑取菌接种于LB试管中，37℃培养过夜，再转接于三角瓶中，继续振落培养2-2.5小时。培养物置冰浴10分钟后，离心收集菌体，并用预冷的氯化钙溶液悬浮，冰浴20分钟后，离心收集菌体，再悬浮于预冷的氯化钙溶液，并分装于Eppendorf管中，冷藏备用。

取一管氯化钙处理过的菌液，加入质粒pHX-hIFNα-2b，冰浴20分钟后，转置42℃水浴2分钟，涂布适量菌液于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养皿中，37℃培养过夜，即得到转化菌菌落。

3、转化菌的筛选：

从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素选择培养基的试管中，37℃振荡培养过夜，分别离心收集菌体。用碱裂解法，将菌体悬浮，氢氧化钠裂解、醋酸钠中和，离心所得上清液，分别用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，离心回收质粒DNA。回收的质粒DNA分别溶解于TE后，用EcoR I/Sal I双酶切，琼脂糖电泳，筛选出含500bp左右小片段的样品。

将筛选所得的携有重组质粒的菌样，分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基，30℃培养过夜。转接于M9培养基中，30℃培养2小时后，42℃继续培养4小时，离心收集菌体。

部分菌体用SDS-PAGE电泳检查全菌蛋白，在15KD处有明显表达条带，占菌体总蛋白的30％左右。

另一部分菌体用盐酸胍溶解，用WISH细胞，以VSV为基本检测系统，按细胞病变抑制法测定生物活性，得到阳性结果。

以上结果说明，构建所得的人基因工作α-2b干扰素生产菌是一个能高效表达人基因工程α-2b干扰素的系统，具有工业化生产价值。

实施例4

菌种稳定性：用上述方法构建成的大肠杆菌DH5α(CCTCC No.M99002)(pHX-IFNα-2b)在LB氨苄青霉素斜面转接50次后提取菌体中的质粒DNA，并用限制性内切酶(EcoR I/Sal I)鉴定，酶切图谱与原菌种相同(图10)。SDS-PAGE图表明，50代次表达水平未见显著差异(图11)。以上结果说明该工程菌是稳定的。