猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步检测

摘要

干扰素(Interferon,IFN)是一类由细胞分泌的,至少在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质。我国是一个养猪大国,猪的各类疾病,尤其是病毒性疾病严重危害了养猪业的发展,降低了经济效益,为此,研制出高效低成本的抗病毒和免疫增强药物是非常重要的应对措施。猪的干扰素具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用,已成为近年来研究的热点。目前已知的猪干扰素有α、β和γ三种,干扰素α属于Ⅰ型,具有广谱的抗病毒作用,且具有速效多能的特点,干扰素γ属于Ⅱ型,除具有抗病毒作用外,还具有较强的免疫调节功能。本实验利用PET-30载体系统,构建了猪IFN-α及IFN-γ基因的原核表达载体,并对重组蛋白的抗病毒活性进行检测。本研究主要分为以下两部分内容:(1)猪a、r干扰素的原核表达和纯化。根据GenBank提供的猪干扰素α和干扰素γ的基因序列设计引物,通过PCR方法扩增出目的基因,构建重组表达质粒,原核诱导表达后,用Ni2+亲和树脂层析柱纯化重组蛋白,从而为进一步研究其抗病毒活性提供了候选蛋白。(2)重组蛋白抗病毒活性的初步检测。采用细胞病变抑制法分别检测重组蛋白在PK15细胞上抗星状病毒复制的活性。结果表明纯化的猪IFN-α和IFN-γ具有一定的抗星状病毒复制的活性。将两个蛋白按照不同比例混合检测抗星状病毒复制的活性,结果显示将猪IFN-α和IFN-γ重组蛋白按照125:1的比例进行混合具有较强的活性。

目录

摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章 绪论

1 干扰素概述

1.1 干扰素的来源和分类

1.2 干扰素的分子结构

1.3 干扰素的生物学活性和作用机制

1.4 基因工程干扰素的临床应用

1.5 前景展望

1.6 研究目的及意义

第二章 猪α、γ干扰素的载体构建、原核表达及纯化

1 材料

1.1 实验菌株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 主要溶液的配制

2 实验方法

2.1 引物设计与合成

2.2 目的基因的扩增及纯化

2.3 PCR 产物和pET30a(+)的酶切

2.4 目的基因与载体连接

2.5 重组质粒的转化

2.6 挑选阳性克隆并鉴定

2.7 重组质粒的提取

2.8 原核表达载体的构建和鉴定

2.9 目的蛋白的诱导表达

2.10 重组蛋白的纯化

3 实验结果

3.1 猪IFN-α及IFN-γ基因扩增结果

3.2 重组质粒的构建

3.3 重组克隆载体的测序与鉴定

3.4 重组质粒的诱导表达结果

3.5 重组蛋白的纯化结果

4 讨论

第三章 重组蛋白抗病毒活性的初步检测

1 材料

1.1 重组表达菌株

1.2 培养细胞与病毒

1.3 主要试剂及仪器

1.4 主要溶液的配制

2 实验方法

2.1 重组蛋白含量的测定

2.2 重组蛋白抗病毒活性的初步检测

3 实验结果

3.1 重组蛋白的含量测定

3.2 星状病毒毒价（TCID50）的测定

3.3 单一重组蛋白抗病毒活性检测

3.4 重组蛋白联合抗病毒活性检测

4 讨论

第四章 结论

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢

上海交通大学硕士学位论文答辩决议书