海带配子体抑制消减文库的生物信息学分析及lhcf5基因的序列特征研究

摘要

本研究将海带配子体eDNA抑制消减文库所产生的627克隆进行测序，按照序列匹配部分大于100 bp并达到95％以上相似性的标准，使用DNAMAN软件去除低质量的EST，将剩下的618条EST聚类成187条TUGs。其中93条为Contigs，它们由524条EST产生，剩下的94条为Singletons，冗余率为69.74％。65条TUGs个序列与已报道的基因有较高的同源性，122条在GenBank上无显著匹配。在已知基因中，大部分与能量代谢、物质转换和蛋白质生物合成相关，其中仅光捕获蛋白基因就有73条，还有一些与生长发育、信号转导、抗逆和防御以及物质运输相关。另外，本研究还对密码子使用进行分析，结果表明：58个Contigs的总G+C含量平均值是0.5146，24个TUGs(1751密码子)中，密码子第三位碱基的G和C含量分别为26.3％和33.5％，TGA、TAG和TAA等3种终止密码子的使用率差别较大，分别为70.8％、12.5％和16.7％。此外，非编码区G和C含量比ORF区略高。本研究为开展海带雌、雄配子体差异表达基因克隆、分析和功能基因组学等研究提供了条件和信息。 根据糖海带(L．saccharina)lhcf5开放阅读框(ORF)及海带配子体消减库中E04克隆的序列设计引物，利用反转录PCR方法获得了海带配子体lhcf5基因的cDNA序列(GenBank登录号：EU751620)。该序列的ORF与糖海带lhcf5编码序列的相似性高达99％，而3’非翻译区(UTR)序列的相似性只有96％。经推测，海带配子体lhcf5基因序列的ORF编码一个含218个氨基酸的前体蛋白LHCF5，其氨基端的40个氨基酸组成信号肽，跨膜酶切后变为含178个氨基酸的成熟蛋白，它的分子量为19.3 kD，等电点为4.86。预测的成熟蛋白LHCF5高级结构存在4个保守性的p折叠和3个跨类囊体膜的α-螺旋区。 根据海带配子体LHCF5成熟蛋白以及GenBank中9个同源蛋白质的氨基酸序列所构建Neighbor-joining分子进化树，显示藻类在光捕获蛋白氨基酸序列水平上存在着红藻、杂色藻类、绿藻等三个方向的演化途径，其中绿藻与高等植物的亲缘关系更近。在本研究中，还根据lhcf5的cDNA序列设计引物对海带配子体基因组DNA运用锚定PCR法扩增，将该结果与此引物所进行的基因组DNA PCR扩增结果拼接，获得了lhcf5基因的DNA序列。通过对lhcf5基因与其cDNA序列的比较，发现在雌、雄配子体LHCF5的信号肽处分别存在着一个1137bp、1135bp长的内含子，为该基因的结构及其功能的进一步研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

引言

第一章海带抑制消减文库生物信息学分析

1.1材料与方法

1.1.1阳性克隆片段的PCR扩增

1.1.2测序及数据分析

1.1.3系统进化树分析

1.2结果

1.2.1 EST的获得

1.2.2 EST聚类分析

1.2.3 EST功能注释与分类

1.2.4密码子使用和GC含量分析

1.3讨论

第二章叶绿素a/c结合蛋白基因lhcf5的cDNA克隆及其序列分析

2.1材料与方法

2.1.1菌株和载体

2.1.2主要试剂

2.1.3海带配子体无性繁殖体系培养

2.1.4引物序列

2.1.5总RNA提取

2.1.6 RACE法扩增基因5'端

2.1.7 PCR产物纯化

2.1.8目的片段的TA克隆

2.1.9阳性克隆鉴定

2.1.10序列分析

2.2结果

2.2.1总RNA质量

2.2.2 5'-RACE

2.2.3利用5'-RACE第一链cDNA扩增结果

2.2.4菌落PCR检测5'-RACE扩增产物的克隆鉴定(图2-4)

2.2.51hcf5基因cDNA全长序列

2.2.6 LHCF5蛋白序列预测及特性分析

2.2.7氨基酸组成与密码子使用分析

2.2.8疏水性及信号肽分析

2.2.9 LHCF5蛋白高级结构预测

2.2.11蛋白质功能位点预测

2.2.12不同物种光捕获蛋白序列的相似性研究及藻类系统分析

2.3讨论

第三章lhcf5基因组DNA的克隆及序列分析

3.1材料与方法

3.1.1菌株和载体

3.1.2主要试剂

3.1.3海带雌雄配子体无性繁殖体系培养

3.1.4引物序列

3.1.5 CTAB法提取海带配子体基因组DNA

3.1.6 DNA定量

3.1.7 DNA定性

3.1.8普通PCR反应

3.1.9单引物PCR

3.1.10巢式PCR

3.2结果

3.2.1总DNA质量

3.2.2普通PCR基因组扩增结果

3.2.3锚定PCR结果

3.3讨论

小结

参考文献

附录一

致谢