低氧通过自噬-凋亡通路介导肺癌细胞系对顺铂敏感性降低的研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述:
　　研究背景:
　　肺癌是当今发病和死亡人数最高的恶性肿瘤。肺癌的治疗仍是以铂类为基础的综合化疗方案,然而目前的化疗效果非常不理想,特别是在进展期的肺癌患者中。有报道称低氧在化疗耐药中起了很关键的作用。但此方面的研究甚少。自噬是生命进化过程中一个非常古老的生物学现象,广泛地存在于动植物细胞内,其旨在清除细胞内受损的细胞器和衰老的蛋白,以维持细胞内环境稳态。自噬是细胞受到应激压力如低氧、药物刺激时产生的一种自我保护机制。在应激压力下,有效的自噬可以保护细胞免受凋亡,以供细胞在应激压力下得以继续生存。而自噬缺陷在某些疾病如肿瘤发生、神经退行性病变中扮演着非常关键的作用。目前,细胞自噬已经成为肿瘤领域的新的研究热点。自噬是否参与了低氧介导的肺癌细胞对顺铂化疗敏感性下降的过程以及其中机制,目前尚不清楚。
　　研究目的:
　　1.检测肺癌组织中的自噬水平;
　　2.探讨顺铂以及低氧条件下肺癌细胞发生自噬的过程;
　　3.研究在低氧条件下,自噬在肺癌细胞系对顺铂的化疗敏感性改变中的作用及其可能的机制。
　　研究方法:
　　1.自噬相关基因Beclin-1和LC3-II在肺癌组织中的表达
　　40例肺癌患者的术后肺癌标本,并以距癌中心5cm的组织作为癌旁对照,采用实时定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学的方法检测自噬特异基因Beclin-1和LC3-II的表达。
　　2.低氧条件下,顺铂对肺癌细胞系A549和SPC-A1细胞活力影响的检测
　　在常氧和低氧条件下,用不同浓度的顺铂处理A549和SPC-A1,后采用MTT法检测细胞活力的变化程度,并确定后续实验的最佳顺铂浓度。
　　3.低氧条件下,顺铂对肺癌细胞系A549和SPC-A1细胞凋亡影响的检测
　　在常氧和低氧条件下,用一定浓度的顺铂处理A549和SPC-A1,后对细胞进行Annexin-V-FITC/PI双标记,用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化程度。
　　4.低氧条件下,顺铂诱导肺癌细胞系A549和SPC-A1自噬的检测
　　(1)采用单丹磺酰尸胺和GFP-LC3标记的方法对A549和SPC-A1进行标记,在常氧和低氧条件下,给予一定浓度的顺铂处理。用激光共聚焦观察细胞发生自噬的情况;
　　(2)采用透射电镜的方法检测A549和SPC-A1发生自噬的情况;
　　(3)用Western Blot的方法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-II的表达。
　　5.低氧条件下,顺铂诱导肺癌细胞系A549和SPC-A1凋亡相关蛋白的检测
　　分离A549和SPC-A1的线粒体和非线粒体组分,制备蛋白。分别检测Bax、Cytochrome C和activated-Caspase-3的表达。
　　研究结果:
　　1.Beclin-1和LC3-II在肺癌组织中的表达显著降低
　　在40例肺癌标本及相应的癌旁组织中均能够检测到Beclin-1和LC3-II mRNA和蛋白的表达,且肺癌组织中Beclin-1和LC3-II mRNA和蛋白的表达水平显著低于其在癌旁组织中的表达水平。免疫组化的结果提示,肺癌组织中Beclin-1和LC3-II表达的阳性细胞比率显著低于癌旁正常肺组织细胞,Beclin-1和LC3-II主要分布在正常肺组织细胞,鳞癌以及腺癌细胞的细胞浆内。
　　2.Beclin-1和LC3-II在肺癌组织中的表达与患者的临床病理资料无相关性
　　将40例肺癌患者按组织学类型、临床病理分期、年龄、性别、吸烟指数的标准进行分组,比较组织学类型、临床病理分期、吸烟指数等因素对肺癌组织中Beclin-1和LC3-II mRNA和蛋白水平的影响,结果提示Beclin-1和LC3-II mRNA和蛋白表达的水平与各组临床资料中均无相关性。
　　3.顺铂对A549和SPC-A1活力的抑制作用在低氧条件下被显著抑制
　　在常氧条件下,随着顺铂浓度的逐渐增大,A549和SPC-A1的细胞活力逐渐下降,而在低氧条件下,顺铂诱导肺癌细胞细胞活力下降的能力显著被抑制。
　　4.顺铂对A549和SPC-A1细胞的凋亡诱导功能在低氧条件下被显著抑制
　　在常氧条件下,顺铂可以诱导A549和SPC-A1细胞发生显著的凋亡现象,而在低氧条件下,顺铂诱导A549和SPC-A1细胞凋亡的能力显著减弱。自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以在低氧条件下显著恢复顺铂诱导A549和SPC-A1细胞凋亡的能力。
　　5.低氧条件下,顺铂诱导A549和SPC-A1细胞的自噬现象显著上升
　　采用MDC染色、GFP-LC3标记、透射电镜的方法均提示在低氧条件下,顺铂诱导A549和SPC-A1细胞发生自噬的能力显著上升,自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以在低氧条件下显著抑制顺铂诱导A549和SPC-A1细胞发生自噬的能力。
　　6.低氧条件下,顺铂诱导自噬相关蛋白的表达显著上升
　　随着顺铂的作用时间的延长,A549和SPC-A1细胞内的Beclin-1和LC3-II蛋白表达逐渐增强,且可以被3-MA所抑制。而在低氧条件下,顺铂诱导的Beclin-1和LC3-II蛋白表达量比常氧下显著增加。同样,在低氧条件下,3-MA也可以显著抑制Beclin-1和LC3-II蛋白的表达。
　　7.在低氧条件下,顺铂诱导的凋亡途径被抑制
　　(1)顺铂能够直接上调A549和SPC-A1细胞的activated-Caspase-3表达。而在低氧条件下,这种上调作用减弱,当给予自噬特异性抑制剂3-MA以后,激活态的Caspase-3再次出现上调;
　　(2)顺铂可以诱导A549和SPC-A1细胞发生线粒体凋亡事件的发生(Bax和CytoC的转位),而在低氧条件下,顺铂诱导A549和SPC-A1细胞发生线粒体凋亡事件的能力被减弱。
　　研究结论:
　　1.肺癌组织里的自噬水平要显著低于相应的癌旁组织;
　　2.低氧条件下,肺癌细胞发生明显的自噬过程。而细胞自噬可以有效地阻碍顺铂诱导的凋亡包括线粒体凋亡途径和非线粒体凋亡途径。从而导致了低氧条件下,肺癌细胞对顺铂的敏感性下降;
　　3.应用自噬特异性抑制剂3-MA,可以有效地恢复顺铂在低氧条件下对肺癌细胞的凋亡诱导功能。
　　研究背景:
　　肺癌是当今发病和死亡人数最高的恶性肿瘤。大部分肺癌患者在确诊时已属晚期,失去外科手术的机会。如果能早期诊断肺癌,对于提高患者的生存率是非常有意义的。肺癌的发生发展是基因调控下的过程,因此从基因水平上研究肺癌是至关重要的。GRIM-1(全反式维甲酸/干扰素诱导细胞凋亡相关基因-1,Gene associated with Retinoid-Interferon-induced Mortality-1)是在全反式维甲酸联合干扰素共同诱导细胞凋亡过程中发现的一个新型凋亡相关的基因,外源性的GRIM-1可以增加细胞对干扰素和全反式维甲酸联合作用的敏感性,目前有关GRIM-1的研究很少,在肺癌中的表达及其临床意义的研究在国内外尚未见文献报道。
　　研究目的:
　　1,研究GRIM-1在肺癌组织中的表达和细胞定位;
　　2,分析GRIM-1在肺癌组织中的表达以及和临床病理资料的相关性。
　　研究方法:
　　1.GRIM-1在肺癌组织中的表达50例肺癌患者的术后肺癌标本,并以距癌中心5cm的组织作为癌旁对照,采用实时定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学的方法检测GRIM-1的表达。
　　2.肺癌组织中GRIM-1表达水平与患者临床病理特征之间的联系将50例肺癌患者按照性别、年龄、吸烟指数、病理类型、TNM分期、淋巴结转移、远处转移及临床病理分期等参数进行分组,研究GRIM-1的表达与这些参数之间的联系。
　　3.GRIM-1在肺癌细胞中的定位免疫荧光的方法标记GRIM-1,激光共聚焦观察GRIM-1在肺癌组织以及相应的癌旁组织中的表达定位。
　　研究结果:
　　1.GRIM-1在肺癌组织中的表达显著降低在50例肺癌标本及相应的癌旁组织中均能够检测到GRIM-1 mRNA和蛋白的表达,且肺癌组织中GRIM-1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于其在癌旁组织中的表达水平。
　　2.GRIM-1在肺癌组织中的表达与患者的临床病理资料无相关性将50例肺癌患者按组织学类型、临床病理分期、年龄、性别、吸烟指数的标准进行分组,比较组织学类型、临床病理分期、吸烟指数等因素对肺癌组织中GRIM-1 mRNA和蛋白水平的影响,结果提示Beclin-1和LC3-II mRNA和蛋白表达的水平与各组临床资料中均无相关性。
　　3.GRIM-1在肺癌组织中的分布定位GRIM-1蛋白在癌旁的正常肺组织、鳞癌、腺癌细胞中均主要分布在细胞浆内。
　　研究结论:
　　1.GRIM-1在肺癌组织中表达显著减弱;
　　2.肺癌组织中GRIM-1的表达与患者的临床病理资料无相关性;
　　3.GRIM-1主要分布在肺癌组织以及相应的癌旁组织细胞的细胞浆中。

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中英文对照词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 自噬在肺癌发病机制以及化疗中的研究

第 一 章自噬相关基因Beclin-1和LC3在肺癌组织中的表达

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

第二章低氧介导的肺癌细胞对顺铂敏感性下降的研究

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4.讨论

参考文献

中文摘要

英文摘要

第 二 部 分GRIM-1在肺癌中的表达及其临床意义的研究

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

下一步的工作设想

附录

致谢

综述