凋亡诱导因子(AIF)凋亡通路介导顺铂肾毒性损伤的研究

摘要

前言：
　　顺铂(cisplatin，CP)，即顺式-二氨二氯合铂，是最有效的肿瘤化疗药物之一，已在临床应用30多年，其抗癌谱广，目前已被广泛应用于治疗睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、宫颈癌、小细胞及非小细胞肺癌等。然而，由于该药对肾脏可发生累积性毒性损伤作用，在接受大剂量CP治疗的肿瘤病人中，约1/5病例可发生急性肾功能衰竭的严重后果，因此其临床应用受到极大的限制。CP的肾毒性作用机制复杂多样，细胞凋亡始终是极为重要的机制之一，过去对凋亡机制的研究主要集中在天冬氨酰酶(caspases)依赖途径。
　　凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)是一种位于线粒体内膜的黄素蛋白。在某些促凋亡信号刺激下，AIF经蛋白水解剪切从线粒体内膜上脱落经开放的线粒体通透性转换孔道(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)被释放，继而发生细胞核转位。AIF在核内可直接引起纯化的细胞核染色质聚集和DNA片断化，无需依赖caspases的级联反应，是非caspase依赖的凋亡途径中的重要蛋白分子。近年来CP通过非caspase依赖如AIF凋亡通路诱导细胞凋亡的现象受到关注，然而对此过程及相关机制尚有争议，并无统一而明确的说法。研究表明AIF上游的重要调节因子是多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶{[poly(ADP-ribose)polymerase]，PARP}。PARP是一种具有促进细胞损伤修复和增加细胞凋亡双重作用的核内蛋白。当某些严重损伤造成PARP过度激活，会引起AIF的核转位，继而造成细胞凋亡；而PARP的抑制剂如3-AB则能抑制AIF核转位。但是关于该调节机制在CP肾毒性机制中的作用，尤其是体内研究仍较缺乏。
　　本课题通对体外(CP作用于肾小管上皮细胞株HK-2)及体内(CP大鼠肾损伤模型)实验，观察CP对HK-2细胞致坏死和凋亡作用，以及对胞质胞核AIF蛋白、核酸表达的影响；再通过细胞保护剂氨磷汀(amifostine，AF)、Z-VAD-FMK、AIF靶向siRNA以及PARP抑制剂3-AB应用，观察对CP肾毒性损伤形态学改变及对细胞凋亡率影响；运用3-AB进一步研究AIF介导的凋亡通路的调节因子与可能机制，从
　　第一部分顺铂(CP)对HK-2细胞的毒性作用
　　目的：观察顺铂(CP)对HK-2细胞的毒性作用
　　方法：不同浓度(0～200μM)和时间(0～24hr)CP作用于HK-2细胞。用台盼蓝染色检测细胞活度，流式细胞仪检测细胞坏死与凋亡情况。WesternBlot检测不同时间CP作用后活化的caspases的表达。用显微镜观察和基因组DNA电泳检测保护剂氨磷汀对CP作用下HK-2细胞的影响。
　　结果：CP导致HK-2细胞活度降低，与剂量和时间呈显著性相关。细胞凋亡率呈一定剂量(0～100μM)和时间(0～24hr)依赖性，分别在100μM(CP作用24hr)和24hr(50μMCP)时达高峰，分别为对照组的5.2倍和5.0倍。CP作用能激活细胞easpase-3，8，9的表达。CP作用6hr时，caspase-8，9开始活化，18hr时分别是12hr时的8.1倍和3.0倍。CP作用12hr时，caspase-3开始活化，18hr和24hr时，其表达分别是12hr的10.5倍和93.7倍。AF对CP致HK-2细胞的坏死和凋亡有明确的保护作用。
　　小结：CP对HK-2细胞毒性作用具有明显的时间和剂量依赖性；较高浓度CP作用，细胞以直接坏死为主要表现，而较低浓度CP作用，细胞则以凋亡为主；CP作用于HK-2细胞，其caspase-8，9和caspase-3先后发生活化；AF能减轻CP致HK-2细胞损伤，对细胞具有保护作用。
　　第二部分AIF通路介导CP诱导HK-2细胞凋亡的研究
　　目的：研究AIF是否介导CP诱导HK-2细胞凋亡
　　方法;采用Western印迹法和荧光实时定量RT-PCR分别检测不同浓度(0～200μM)和时间(0～12hr)CP作用下，体外培养HK-2细胞的胞质和胞核AIF蛋白及AIFmRNA表达。采用免疫荧光染色检测CP作用下HK-2细胞AIF表达分布。采用TUNEL法和流式细胞仪检测泛caspase抑制剂和AIF靶向siRNA对CP作用下HK-2细胞凋亡的抑制作用。
　　结果:HK-2细胞经不同浓度和时间CP的作用，其胞质AIF(cAIF)、胞核AIF(nAIF)及其mRNA表达均有不同程度增加。cAIF表达在CP浓度25μM作用12hr和CP浓度50μM作用3hr起均有升高，其差异分别是对照组的2.3倍(P<0.05)和1.7倍(P<0.01)；nAIF表达呈一定浓度和时间依赖性，在CP浓度150μM作用12hr和CP浓度50μM作用9hr达高峰，其差异分别为25μM组的4.3倍和3hr组的3.7倍。nAIF表达与PARP剪切片断(cleaved-PARP)表达趋势基本一致。AIFmRNA表达在CP浓度50μM作用0～9hr呈梯度增加。免疫荧光结果显示，经CP作用，部分HK-2细胞发生AIF核转位。泛caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)和AIF-siRNA对CP诱导细胞凋亡抑制率分别为60.1％和39.2％，两者联合应用对其抑制作用更明显。
　　小结:CP上调HK-2细胞AIF核酸和蛋白表达，nAIF和cleaved-PARP表达呈显著的剂量依赖性，nAIF表达具一定时间依赖性：CP诱导AIF发生从胞质线粒体到核的转位；AIFsiRNA干扰和Z-VAD-FMK均可部分抑制CP诱导的HK-2细胞凋亡，两者联合应用作用加强。
　　第三部分3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对CP肾毒性损伤的保护作用
　　目的:探讨3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对CP肾毒性损伤的保护作用及可能机制
　　方法:将HK-2细胞分为4组：对照组、CP组、CP+3-AB组、3-AB组，WesternBlot分别检测细胞PAR、μ-calpain、AIF蛋白表达，Hoechst33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡。将细胞分为5组：对照组、CP组、CP+3-AB组、3-AB组，CP+3-AB+LY294002组，WesternBlot检测磷酸化Akt(p-Akt)表达。SD大鼠分成4组：正常对照组、CP处理组、3-AB保护组和AF保护组，HE染色显示3-AB、AF对肾毒性作用的影响，AIF免疫组化染色显示肾小管上皮AIF表达变化，WesternBlot检测皮髓交界肾组织PAR、μ-calpain、AIF蛋白表达。
　　结果:体外实验：与对照组相比，CP组PAR、62KD和57KDAIF表达增加，μ-calpain表达减少(提示活化)，3-AB能减少PAR和57KDAIF表达，抑制μ-calpain活化；3-AB能明显减少CP导致的凋亡现象，对CP作用的HK-2细胞有保护作用；3-AB能进一步增加CP作用下p-Akt表达。体内实验：3-AB和AF能减轻CP导致的大鼠肾损伤，3-AB能减少近端小管上皮细胞AIF表达；与正常对照组相比，CP处理组PAR、62KD和57KDAIF表达增加，μ-calpain表达减少，3-AB能减少PAR和57KDAIF表达，抑制μ-calpain活化。
　　小结:PARP抑制剂3-AB可抑制CP作用下PAR形成、μ-calpain活化，及截断型AIF的表达；3-AB对CP诱导的HK-2细胞凋亡有抑制作用；3-AB和AF均能减轻CP的大鼠肾毒性作用；3-AB对CP作用下HK-2细胞PI3K/Akt通路有进一步活化作用。
　　结论:
　　1.较高浓度CP作用，细胞以直接坏死为主，较低浓度CP作用，细胞以凋亡为主；CP引起HK-2细胞凋亡既通过死亡受体途径，也通过线粒体途径。
　　2.AIF参与介导CP诱导HK-2细胞凋亡。
　　3.3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对CP肾毒性损伤具有保护作用，与其减少PAR形成、抑制μ-calpain活化，减少截断型AIF的表达及激活PI3K/Akt通路可能有关。