过敏性紫癜血清IgA1诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的体外实验研究

摘要

目的：
　　通过观察HSP患儿血清IgA1和正常儿童血清IgA1对体外培养的HUVECs凋亡诱导作用,及其对P53、Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响,探讨IgA1诱导内皮细胞凋亡的分子机制,为明确IgA1在HSP血管损伤中的作用提供实验依据。
　　方法：
　　1.血清采集及IgA1的分离提取2010年9月-2011年1月在本院儿科住院明确诊断HSP的初发患儿10例,10名与HSP患儿同时期、同地区无风湿免疫性疾病史的门诊健康体检儿童作为正常对照。所有受试患儿清晨空腹采取外周静脉非抗凝全血5ml,分离血清。亲和层析法分离提取血清IgA1。
　　2.实验分组用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640常规培养HUVECs,依据培养条件不同分为3组:①HSP组:用含不同浓度(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml)HSP患儿血清IgA1的RPMI-l640培养;②正常对照组:用含不同浓度(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml)正常儿童血清IgA1的RPMI-l640培养;③空白对照组:用不含IgA1的RPMI-l640培养。
　　3.细胞凋亡的观察与检测光学显微镜下观察IgA1诱导前后各组HUVECs形态学变化;各组于诱导因素加入后12h和24h分别收集一次细胞,行流式细胞仪(FCM)和TUNEL法检测细胞凋亡率。
　　4.凋亡相关基因检测0.25mg/mlIgA1诱导HUVECs24h时应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)和蛋白质印记技术(Western blot)检测各组HUVECs中凋亡相关基因P53、Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA及蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.光学显微镜下观察可见IgA1诱导24h时HUVECs圆缩,体积缩小,与周围细胞脱离,HSP组较正常对照组改变更加明显。
　　2.各组HUVECs诱导培养12h时,HSP组和正常对照组FCM法IgA1为0.25mg/ml,TUNEL法IgA1为0.1mg/ml时,即可诱导内皮细胞发生明显凋亡(P<0.01),但HSP组与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。在诱导培养24h时,HSP组和正常对照组IgA1为0.1 mg/ml时即可诱导内皮细胞发生明显凋亡(P<0.01),HSP组凋亡率与正常对照组相比显著增加(P<0.01),且随着IgA1浓度增加及诱导时间延长,细胞凋亡率逐渐增加(P<0.01)。
　　3.0.25mg/ml IgA1诱导24h时,HSP组和正常对照组与空白对照组相比, P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达均明显增多,Bcl-2 mRNA表达均明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);HSP组P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达的增加和Bcl-2 mRNA表达的减少较正常对照组变化更为显著(P<0.05)。
　　4.0.25mg/ml IgA1诱导各组HUVECs24h时,HSP组和正常对照组与空白对照组相比,P53、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增多,Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.01);HSP组与正常对照组相比也有显著性差异(P<0.01)。
　　结论：
　　1.IgA1可以诱导体外培养HUVECs凋亡,HUVECs凋亡率与IgA1的剂量和作用时间具有一定的量效时效关系,当作用时间及IgA1浓度相同时,HSP患儿血清提取的IgA1对HUVECs的凋亡诱导作用更强。
　　2.IgA1诱导体外培养HUVECs凋亡的机制可能与上调促凋亡基因P53、Bax、Caspase-3表达,下调抑制凋亡基因Bcl-2表达有关。

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1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3统计学方法

3 结果

3.1 IgA1诱导下HUVECs的形态学改变

3.2 IgA1诱导HUVECs凋亡的量效时效关系

3.5 IgA1作用下各组HUVECs中P53、Bax、Bcl-2、Caspase-3mRNA表达

3.6 IgA1作用24h时各组HUVECs P53、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达

4 讨论

4.1 IgA1在HSP内皮细胞凋亡中的作用探讨

4.2 P53与IgA1诱导体外培养HUVECs凋亡的关系

4.3 Bcl-2家族与IgA1诱导体外培养HUVECs凋亡的关系

4.4 Caspase-3与IgA1诱导体外培养HUVECs凋亡的关系

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述