载脂蛋白A-I对Ox-LDL诱导的人动脉壁损伤的保护作用

摘要

本实验采用胶原酶灌注消化法,从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉内皮细胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC),用含有牛脑垂体提取物等辅助添加物的培养基进行扩增培养之后,获得可用于实验的健康的内皮细胞。采用组织块贴块法,从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉平滑肌细胞(humanumbilical artery smooth muscle cells,HUASMC),进行扩增培养之后,获得可用于实验的健康的平滑肌细胞。用含有抗坏血酸(≥50μg/ml)的培养基孵育平滑肌细胞,使之合成并分泌胶原蛋白,形成内皮细胞的生长基质;然后将内皮细胞以饱和密度接种到平滑肌细胞上,使内皮细胞和平滑肌细胞直接接触并融合形成内皮细胞-平滑肌细胞共培养(EC-SMC Coculture)模型。　　 共培养模型采用免疫荧光染色法(immunofluorescent staining)进行形态学鉴定。分别对内皮细胞的凝血因子-8相关抗原(FactorⅧ related antigen)和平滑肌细胞的α-肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin)进行免疫荧光染色,然后针对共培养模型的同一视野分别拍摄内皮细胞和平滑肌细胞的荧光照片,将照片叠加后即得到共培养模型的形态学特征。结果显示,两种细胞已成功融合,模拟出体内动脉壁的形态。　　 共培养模型采用Dil-Ac-LDL吞噬实验进行功能学鉴定,用含Dil-Ac-LDL(5μg/ml)的培养基孵育共培养模型2小时,可观察到细胞内的荧光信号,证明共培养模型可行使人动脉壁的功能。　　 分别令共培养模型和单纯内皮细胞(EC monoculture or EC monolayer)进行Dil-Ac-LDL吞噬反应,分别提取细胞内液进行荧光测定,结果显示共培养模型Dil-Ac-LDL的内吞量显著高于单纯内皮细胞,证明共培养模型中内皮细胞与平滑肌细胞已建立联系,使其具有更好的生理功能。　　 本实验采用改良的冷乙醇沉淀法,从血浆F-Ⅳ组分中提取纯化人血浆载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I,ApoA-I),经聚乙二醇浓缩后,用150 mmol/L磷酸缓冲液透析,得到可用于实验的纯化的ApoA-I。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(westernblot)鉴定分离得到的蛋白为纯化的ApoA-I(纯度为98.4％,Mr为28kD)。对LPS激活的巨噬细胞细胞毒性抑制作用的实验显示,制备得到的ApoA-I具有天然ApoA-I的生物活性。　　 用超速离心法分离获得人血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),经生理盐水透析、聚乙二醇浓缩后,使浓度达到2-3mg/ml。加入CuSO4(终浓度为200μM)37℃氧化20小时,经生理盐水透析除去铜离子后获得可用于实验的Ox-LDL。用硫代巴比妥酸法测定制备Ox-LDL的氧化比值,用琼脂糖电泳鉴定制备Ox-LDL的迁移率。　　 用Ox-LDL诱导人脐动脉内皮细胞表达趋化因子(chemokine),主要是单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)。实验按照阴性对照组、炎症组100μg/ml Ox-LDL、治疗组100μg/ml Ox-LDL+100μg/ml ApoA-I分组,在无血清、无辅助添加物条件下孵育内皮细胞获得条件培养基。用THP-1细胞进行趋化实验(chemotaxis experiment),实验结果表明ApoA-I显著降低Ox-LDL诱导的内皮细胞表达的趋化因子造成THP-1细胞的迁移率:阴性对照组(7.7±1.5％)、Ox-LDL炎症组(69.0±3.5％)、Ox-LDL+ApoA-I治疗组(40.3±7.1％),其中炎症组和治疗组比较,P＜0.05。　　 在利用动脉壁共培养细胞进行趋化效应预实验中,初步显示ApoA-I具有抑制Ox-LDL诱导的THP-1细胞趋化效应。　　 以上结果表明:(1)通过胶原酶灌注消化法成功获得人脐动脉内皮细胞;(2)通过组织块贴块法成功获得人脐动脉平滑肌细胞;(3)成功建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型,可模拟人动脉壁形态,并行使正常的人动脉壁功能;(4)ApoA-I具有显著降低Ox-LDL诱导的人脐动脉内皮细胞表达趋化因子的功能。