大鼠脊髓胶质细胞在癌痛中的功能活动变化及电针缓解癌痛作用观察

摘要

癌痛即恶性肿瘤引起的疼痛，是临床上常见的慢性病理性疼痛之一，严重影响了患者的生活质量。据统计资料表明，肿瘤患者中约有30-50％伴有轻到中度的疼痛，而在肿瘤晚期或转移性肿瘤患者中，约有75-95％的患者伴有严重的疼痛而需要接受治疗。依据WHO倡导的三阶梯疗法，即根据疼痛程度不同给予非甾体类抗炎镇痛药和/或阿片类药物治疗，取得了一定的成效。但是由于目前各种疗法的局限性，仍有大约45％的癌痛患者的疼痛得不到有效控制。因此，建立适宜的癌痛动物模型，为研究癌痛机理及寻找新的能有效缓解癌痛的方法奠定基础，这是当前慢性痛研究领域的热点之一。 研究证明，癌痛时脊髓背角强啡肽免疫阳性神经元增加，同侧脊髓背角星形胶质细胞显著增生，这一现象在炎症痛模型中非常罕见，在神经痛模型上只有外周神经严重损伤时才会出现。以往研究提示癌痛是一种机理独特的慢性痛。越来越多的证据表明，神经胶质细胞与慢性痛密切相关。一方面，胶质细胞在主要的痛觉传递物质谷氨酸的代谢、摄取、合成、清除中起重要作用，另一方面，胶质细胞释放的致炎细胞因子(IL-1β、IL一6、TNF-α等)、前列腺素等是引起痛觉传递神经元敏化的主要因素，促进中枢敏化形成。因此，胶质细胞在痛觉的初级传入和整合中起重要作用，在痛觉调制尤其是慢性痛中枢敏化的形成与维持中起着举足轻重的作用。那么胶质细胞在癌痛时到底有何变化是本课题研究的一个问题。 针刺镇痛是祖国医学的精华之一，具有作用广，毒副作用小，经济简便等优点。国内外大量研究表明，针刺对急性痛和慢性痛都有一定的镇痛作用。临床实践初步提示，应用针刺于癌痛病人，不仅能够镇痛，还能通过针刺调节癌症患者的免疫功能，从而有助于提高癌症患者的生活质量。但是长期以来，由于缺乏合适的癌痛实验动物模型，阻碍了对癌痛机理的研究，也就影响了新的有效的癌痛治疗方法的研究，包括一些癌痛新药及针刺等非药物疗法等。直到1998年，Wacnik等首先报道了小鼠癌痛模型，而后又有多个癌痛实验动物模型相继问世。这些癌痛动物模型的出现为开展中西医结合针刺及针药结合治疗癌痛提供了契机。 综上所述，本论文拟开展下列研究： 1．建立癌痛动物实验模型 (1)参照。Medhurst等报道的大鼠胫骨癌痛模型，改良、建立新的大鼠胫骨癌痛模型，通过测定模型大鼠体重、胫骨病理、胫骨X光片、后肢热痛觉过敏、机械性痛觉超敏(触诱发痛)、双侧后肢负重能力以及自发性疼痛，对模型进行综合评估； (2)建立新的大鼠跟骨癌痛模型，通过测定后肢热痛觉过敏、机械性痛觉超敏等对模型进行评估； (3)参照文献，建立小鼠皮肤癌痛模型，通过测定小鼠脚掌皮肤黑色素瘤肿胀周长、热痛觉过敏对模型进行评估； 2．观察癌痛时大鼠脊髓背角胶质细胞功能活动变化，探讨胶质细胞在癌痛中的作用 (1)运用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达变化； (2)运用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CD11b的表达变化； (3)运用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角少突胶质细胞标记蛋白MOSP的表达变化； (4)运用RT-PCR和ELISA方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角致炎细胞因子IL一1β、IL-6、TNF-α的表达变化； (5)运用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角Toll样受体(Toll likereceptor，TLR)的表达变化； 3．观察电针和/或西乐葆对癌痛的缓解作用 (1)观察电针对小鼠皮肤癌痛时热痛觉过敏的影响； (2)观察电针对大鼠胫(跟)骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响； (3)观察不同剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响； (4)观察电针合用小剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响。

目录

论文说明:英文缩写词表

声明

前言

材料与方法

1材料

1.1实验动物

1.2试剂

1.3仪器

2方法

2.1大鼠胫骨癌痛模型的制作与评估

2.2大鼠跟骨癌痛模型的制作与评估

2.3小鼠皮肤癌痛模型的制作与评估

2.4电针治疗方法

2.5“假电针”治疗方法

2.6药物配制与给药方法

2.7骨石蜡切片制作

2.8组织切片的制备

2.9免疫组织化学法(ABC法)

2.10组织总蛋白的提取

2.11 Bradford法测定蛋白质含量

2.12 SDS-PAGE凝胶电泳

2.13 Western 印迹法检测蛋白质

2.14组织总RNA提取(Trizol一步法)

2.15逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

2.16酶联免疫吸附法(ELISA)

2.17数据统计

2.18有关溶液的配制

结果

第一部分 癌痛实验动物模型的建立

1.1大鼠胫骨癌痛模型

1.2大鼠跟骨癌痛模型

1.3小鼠皮肤癌痛模型

第一部分总结

第二部分 大鼠胫骨癌痛时脊髓胶质细胞功能活动变化

2.1大鼠胫骨癌痛时脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达变化

2.2大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CDllb的表达变化

2.3大鼠胫骨癌痛时脊髓背角少突胶质细胞标记蛋白MOSP的表达变化

2.4大鼠胫骨癌痛时脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达变化

2.5大鼠胫骨癌痛时脊髓背角Toll样受体mRNA的表达变化

第二部分总结

第三部分 观察电针和/或西乐葆对癌痛的缓解作用

3.1电针对小鼠皮肤癌痛时热痛觉过敏的影响

3.2电针对大鼠胫(跟)骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响

3.3不同剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛阈的影响

3.4电针合用小剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛阈的影响

第三部分总结

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

综述一 癌痛实验研究进展

综述二 大麻的疼痛调制作用及其机制