5-氨基酮戊酸光动力(ALA-PDT)对表皮葡萄球菌浮游菌和生物膜抗菌效应研究

摘要

表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是人体皮肤和粘膜上定居的正常菌群之一,通常情况下致病力较弱。随着各种有创性治疗方法的开展及人口老龄化、免疫力低下人群的出现等,凝固酶阴性的葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌引起的院内感染发生率呈逐年增高趋势,甚至已经超过金黄色葡萄球菌,成为院内感染的重要致病菌之一。据报道,在皮肤及软组织感染、烧伤创面、溃疡及湿疹皮炎等部位极易引起表皮葡萄球菌感染,表皮葡萄球菌之所以成为目前关注的重点,是因为表皮葡萄球菌可以粘附于物体或病灶表面形成生物膜(Bacterial biofilm,BBF)而致病。BBF可以保护内部细菌逃避抗菌药物及宿主免疫杀伤,而且生物膜持续释放细菌进入血流引起感染的慢性及反复发作,临床常规抗感染治疗难以凑效。
　　光动力疗法( photodynamic therapy, PDT)是一种新型的非侵入性治疗手段,通过光敏剂选择性聚集于靶细胞,在相应波长光源照射下,组织细胞产生单线态氧和自由基等细胞毒性物质从而对靶细胞产生选择性杀伤作用。20世纪90年代以前,PDT的研究主要集中于肿瘤的诊断和治疗,在近20年的皮肤科临床研究与应用中,该技术愈加成熟与完善。近年来,随着新型光敏剂的出现和应用,以及治疗技术的改进,在非肿瘤性疾病特别是细菌性疾病和病毒性疾病的治疗上PDT也取得了显著的疗效。国外已有学者采用不同的光敏剂进行PDT抗菌研究,并取得了良好的抑菌效果,但尚未见ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜相关抗菌研究。由于实验条件、光敏剂及光源的不同,所报道的PDT治疗参数差别较大。本课题从ALA在细菌体内的荧光药代动力学开始,研究表皮葡萄球菌对ALA的吸收和转化为原卟啉IX(Protopophrin IX,PpIX)的情况,寻找PpIX的峰值时间,确定最佳照光时间点;进一步探讨ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜的抗菌效应,寻找最佳光敏剂浓度和光照剂量。
　　目的：
　　1、研究ALA在细菌体内转化为PpIX的荧光药代动力学,确定最佳敷药时间。2、探讨不同药物浓度和不同光照剂量的ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效应,建立有关ALA-PDT治疗细菌感染的最佳参数,如: ALA药物浓度及照光剂量。
　　3、建立细菌生物膜研究模型,为进一步研究ALA-PDT对细菌生物膜抗菌效应提供研究模型。
　　4、探讨ALA-PDT对细菌生物膜的抗菌效应,建立ALA-PDT治疗细菌生物膜感染的最佳参数,如:ALA药物浓度及照光剂量。
　　方法：
　　1、明确PpIX荧光强度与敷药时间和药物浓度的关系。
　　实验分为三组:第一组采用50mM ALA与表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM检测不同时间点的PpIX荧光强度,明确相同浓度的 ALA在细菌体内转化为 PpIX的荧光强度是否和孵育时间有关;第二组采用不同浓度 ALA(10、20、30、40、50mM)与细菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM检测PpIX荧光强度,明确不同浓度ALA孵育相同时间后,在细菌体内转化为 PpIX的荧光强度是否与药物浓度有关;第三组为阴性对照组(不加ALA),避光共孵育24h后,CLSM检测PpIX荧光强度,明确表皮葡萄球菌是否含有内源性PpIX。
　　2、确定ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效应相关参数(光照剂量和药物浓度)。
　　实验分为三组:第一组采用50mM ALA与表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育16h后给予不同剂量(30、50、70、90、100J/cm2)的红光照射;第二组采用不同浓度 ALA(10、20、30、40、50mM)与细菌37℃,避光共孵育16h后,给予100J/cm2的红光照射;第三组为阴性对照组,采用单纯 TSB培养基(不加ALA)培养细菌16h,不进行光照处理。三组标本均通过菌落计数法分析 ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌的抗菌效应,明确 ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用的最佳药物浓度和照光剂量。
　　3、建立细菌生物膜研究模型。
　　采用24孔细胞培养板,盖玻片上形成生物膜,荧光技术标记细菌,结合 CLSM观察生物膜的形成情况,为进一步研究 ALA-PDT对细菌生物膜的抗菌效应提供研究模型。
　　4、探讨ALA-PDT对细菌生物膜的抗菌效应。
　　实验分为治疗组和对照组,治疗组生物膜制备的同时加入 ALA孵育,培养16h后给予不同剂量(100-300J/cm2)的红光照射。对照组不加 ALA,培养16h,不进行光照处理。两组分别通过菌落计数法分析 ALA-PDT对细菌生物膜抗菌作用;CLSM检测 ALA-PDT对细菌生物膜活力的影响;SEM检测 ALA-PDT对细菌生物膜形态结构的影响。
　　结果：
　　1、PpIX荧光强度与敷药时间和药物浓度的关系
　　第一组,50mMALA与细菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM下均观察到 PpIX砖红色荧光,荧光强度随着孵育时间的延长而逐渐增强,孵育16、18、20、24h的荧光强度明显高于3、5、8、12h(p﹤0.05);第二组,10、20、30、40、50mM的ALA与细菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM下均观察到 PpIX砖红色荧光,PpIX荧光强度随着 ALA浓度的增加而增强,50mM浓度组PpIX荧光强度明显高于10、20、30、40mM浓度组(p﹤0.05);第三组,单纯TSB培养基不加ALA与细菌37℃,避光共孵育24h后,未见PpIX砖红色荧光。
　　2、不同光照剂量和药物浓度的ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用
　　第一组,随着光照剂量的增加(30、50、70、90、100J/cm2),存活的细菌数逐渐减少,当光照剂量达到100J/cm2时,无菌落生长。各剂量组疗效与对照组比较,差异有统计学意义(p﹤0.01),各剂量组疗效两两比较,差异有统计学意义(p﹤0.01)。第二组:随着 ALA浓度的增加(10、20、30、40、50mM),存活的细菌数量逐渐减少,50mM ALA组无菌落生长。各浓度组疗效与对照组比较,差异有统计学意义(p﹤0.01),各浓度组疗效两两比较,差异有统计学意义(p﹤0.01)。
　　3、生物膜制备结果
　　表皮葡萄球菌(ATCC35984)培养16h后形成且肉眼可见灰白色、膜状物,平铺在盖玻片上,经荧光染色后,在 CLSM下观察,可见该膜状物呈现绿色荧光,并有一定的厚度,膜内细菌形成致密结构,并有许多细胞聚集成团,细胞周围有许多基质,并被网状管道所分隔。纵切面和横切面上可以观察到膜表面有少量的浮游菌将扫描表皮葡萄球菌生物膜后得到的数据,用专业软件进行处理,得到了表皮葡萄球菌生物膜的三维立体图像,可形象的观察到生物膜中细菌聚集成一团,像一个个小山包,组成了石林一样的图像,有些团块中空,像有管道穿入其内。这更形象地说明了生物膜具有三维立体的结构,且形态具有多样、不均质、开放的特点,这和以前的研究报道相似,为我们进一步研究 ALA-PDT对表皮葡萄球菌生物膜抗菌效应提供了研究模型。
　　4、ALA-PDT对生物膜细菌的抗菌效应
　　治疗组经不同剂量的红光照射后,菌落计数法观察到存活的细菌数呈逐渐减少趋势,经统计学处理,各光照剂量组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),各剂量组两两相比差异有统计学意义(P<0.01);CLSM下观察到生物膜细菌活力逐渐降低,死菌/活菌比例逐渐增高,各剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),各剂量组两两相比差异有统计学意义(P<0.01);SEM观察到生物膜结构疏松,随着光照剂量的增加,生物膜结构逐渐模糊,当光照剂量达300J/cm2时,生物膜结构消失,多数细菌呈单菌落分布。
　　结论：
　　1、表皮葡萄球菌能很好的吸收ALA并在菌体内转化为PpIX,PpIX在CLSM下呈现砖红色荧光,且荧光强度随着孵育时间和 ALA浓度的增加而逐渐增强,表皮葡萄球菌本身不含内源性的PpIX。
　　2、ALA-PDT对表皮葡萄球菌浮游菌有明显的生长抑制作用,当达到最适治疗参数即50mM ALA,孵育16h、100 J/cm2的光剂量,可以灭活浮游表皮葡萄球菌。3、成功制备了表皮葡萄球菌(ATCC35984)生物膜,生物膜内含有大量基质,细菌在基质包裹下聚集成团,大量增殖,形成膜状结构;另外,生物膜具有空间内立体结构,可以作为研究模型。
　　4、ALA-PDT对生物膜有一定的杀菌作用,不仅可以降低生物膜活力,还能破坏生物膜的结构。

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引言

第一章

1.1引言

1.2材料与方法

1.3结果

1.4讨论

1.5结论

第二章

2.1 引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5 结论

第三章ALA-PDT对表皮葡萄球菌生物膜抗菌效应研究

第一节表皮葡萄球菌生物膜研究模型的建立

第二节 ALA-PDT对表皮葡萄球菌生物膜抗菌效应研究

参考文献

附录

致谢

综述