携带CARex和PTDtat的重组5型腺病毒的获得及其对日本血吸虫童虫感染效率的研究

摘要

目的:RNAi已经成为生物体基因功能分析的非常重要的工具,虽然有文献报道成功地将dsRNA通过浸泡或电穿孔方法导入血吸虫各期达到基因沉默作用,然而这一技术在血吸虫研究应用中目前仍然存在一些问题,包括如何高效的将dsRNA、siRNA或shRNA表达载体高效地递送到虫体、降低递送方法导致的死亡和达到长期干扰效果,RNAi的长期应用就需要克服这些难关。本课题主要是研究Ad5能否感染日本血吸虫童虫,及其感染效率如何,并且对Ad5进行了改建,插入可以提高Ad5感染效率的基因来增加Ad对日本血吸虫的感染的可能性,作为Ad5应用于日本血吸虫童虫RNAi的前期研究,为探索腺病毒载体介导的日本血吸虫童虫RNAi奠定初步的实践基础。
　　方法:通过体外连接方法成功构建携带CARex、PTDtat和CARex-PTDtat融合基因的重组5型腺病毒质粒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat质粒;经PacI酶切线性化在脂质体的介导下转染293A细胞,在包装细胞293A细胞中成功包装出具有感染力的重组病毒颗粒;扩增3代后,PCR鉴定目的基因的成功插入,然后用半数组织培养感染量(TCID50)法测定病毒颗粒的滴度,滴度在108-109之间,为了得到高滴度的重组腺病毒,用氯化铯密度梯度离心法对重组腺病毒进行纯化,纯化后的病毒滴度为1011。用3种重组腺病毒和野生型腺病毒分别感染CAR表达量不同的肿瘤细胞株,包括高表达的A549、中表达的HepG2和低表达的T24细胞,48h后倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,然后流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比及荧光强度。收集50只日本血吸虫阳性钉螺的尾蚴,通过机械法将尾蚴转化为童虫,然后进行童虫实验分别于48h后倒置荧光显微镜观察观察GFP在童虫体内的表达情况。
　　结果:成功构建和包装重组5型腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat,细胞实验显示重组腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat组细胞GFP的表达量均高于野生型pAd,但是pAd-CARex-PTDtat作用效果要低于pAd-CARex和pAd-PTDtat组。流式细胞术显示在A549、HepG2和T24细胞GFP阳性细胞的百分比是:野生型pAd组分别为54.8％、38.2%和8.52%;经改建的重组pAd-CARex组分别为90.4%、79.2%和32.1%;重组pAd-PTDtat组分别为95.8%、98.8%和93.9%;重组pAd-CARex-PTDtat组分别为70.5%、53.4%和13.3%,在3种细胞中重组pAd-CARex与野生型pAd组相比较GFP阳性细胞数平均提高33%,并且在3种细胞提高的百分比无明显差别;重组pAd-PTDtat组平均提高61.6%,在T24细胞中提高近85%,在A549细胞提高了41%,在HepG2细胞提高了60%,具有明显的作用效果,重组pAd-CARex-PTDtat平均提高仅仅约10%。4种重组病毒的平均荧光强度在A549细胞最强,HepG2次之,T24最弱。各组细胞平均荧光强度中pAd-PTDtat组最强,pAd-CARex次之,pAd-CARex-PTDtat组最弱,但是3组都高于野生型pAd。童虫实验结果显示:荧光显微镜检查野生型pAd组、pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat均未见到GFP的表达,只有PTDtat组能看到微弱的GFP的表达。
　　结论:实验结果表明CARex、PTDtat基因可以提高Ad5对CAR表达量的不同肿瘤细胞的感染效率,尤其是低表达CAR的肿瘤细胞,PTDtat基因的作用效果优于CARex,但是将两者联合在一起作用效果反而较差;童虫实验结果显示野生型pAd和pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat不能感染日本血吸虫童虫,只有经过改建后的重组腺病毒pAd-PTDtat对童虫有微弱的感染,说明PTDtat基因的作用效果较好,可以提高Ad5对肿瘤细胞和日本血吸虫童虫的感染效率。

目录

中英文缩略词对照表

中文摘要

英文摘要

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果

3.1 重组穿梭质粒的酶切鉴定

3.2 重组腺病毒质粒的酶切鉴定

3.3 重组腺病毒的包装和扩增

3.4 重组腺病毒PCR鉴定

3.5 重组腺病毒滴度测定

3.6 倒置荧光显微镜观察重组腺病毒对肿瘤细胞感染效率

3.7流式细胞术检测重组腺病毒对肿瘤细胞感染效率

3.8 重组腺病毒感染童虫的结果

4讨论

4.1 RNAi在血吸虫存在的问题

4.2 腺病毒优点

4.3 CAR功能及其机制

4.4 PTDtat功能及其机制

4.5 实验结果讨论

5结论

参考文献

附录一 部分试剂配方

附录二 个人简历

致谢

附录四 综述