日本血吸虫表膜特异结合肽重组质粒ZLW/pEGFP-C2体外转染日本血吸虫童虫的研究

摘要

目的观察日本血吸虫表膜特异结合肽合成基因(ZLW)构建的ZLW/pEGFP-C2重组质粒体外转染日本血吸虫童虫的效率,了解其抗虫作用。方法用0.75%二甲基亚砜(DMSO)和高浓度质粒浸泡法,使用重组质粒ZLW/pEGFP-C2转染机械转化的日本血吸虫脱尾童虫,以瞬时表达的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,在倒置荧光镜下观察虫体。抽提转染后培养48h虫体的总RNA和全虫蛋白,分别用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)检测ZLW基因和EGFP基因在虫体内的表达情况。于转染后培养24、48、72和96h,用美蓝染色法鉴别虫体存活情况,并计数。以上试验均设空质粒组和Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)对照组。结果镜下观察结果显示,转染率约为10%,其EGFP主要分布于虫体皮层,以口、腹吸盘最为明显;空质粒转染组虫体腹吸盘处略带绿色荧光。RT-PCR结果显示,ZLW/pEGFP-C2转染组虫体的扩增产物大小约为259bp,测序结果与ZLW序列一致。Western blotting分析证实EGFP基因在童虫体内表达。抗虫效果显示,转染后24h和48h,ZLW/pEGFP-C2转染组童虫死亡率(14.0%,48.8%)与空质粒组(15.9%,45.7%)和TBS对照组(16.9%,50.3%)间的差异无统计学意义(P>0.05);转染后72h,ZLW/pEGFP-C2转染组死亡率(92.7%)高于空质粒组(73.2%)和TBS对照组(76.8%)(P<0.01);转染后96 h,ZLW/pEGFP-C2转染组童虫死亡率达100%。结论 DMSO作用的高浓度质粒浸泡法可将重组质粒ZLW/pEGFP-C2引入日本血吸虫童虫体内,并获得表达。