金属硫蛋白基因酿酒酵母工程菌吸附铀(Ⅵ)、钍(Ⅳ)的研究

摘要

生物吸附是目前最有前景的吸附方法之一，如何提高现有微生物材料对离子的吸附量及吸附特异性，亟需开发新型生物吸附材料。研究表明，微生物细胞如真菌、细菌、藻类和生物材料等对溶液中的铀（Ⅵ）、钍（Ⅳ）离子均有较强的生物吸附性能。已有研究认为，与金属离子具有较强络合作用的生物吸附剂中含氨基酸残基，对溶液金属离子都具备较强结合功能，这类物质最典型的就是金属硫蛋白（MT）。本文通过基因工程技术，将金属结合蛋白固定在细胞外膜，开发出新型高效的生物吸附铀（Ⅵ）、钍（Ⅳ）离子材料。主要研究和结果如下：　　本研究通过搜索 Genebank数据库，获得了人肝金属硫蛋白基因的 DNA序列；通过分析酿酒酵母菌密码子使用的规律，用偏爱密码子代替稀有密码子，同时，在C端和N端分别添加XhoI和BamHI酶切位点及保护碱基，合成了改造的金属硫蛋白基因（MT）；将酿酒酵母表面展示载体pYD1经XhoI和BamHI双酶切，回收约5kb的产物，与经过相同酶切的 MT基因连接，获得了酿酒酵母重组表达载体pYD-MT；提取重组质粒pYD-MT，用醋酸锂法将pYD-MT导入酿酒酵母EBY100感受态细胞中，构建得到酿酒酵母表面展示重组菌SS-MT。将重组菌SS-MT细胞在含有半乳糖的培养基中进行培养，诱导 MT蛋白的表达，经免疫荧光检测证明金属硫蛋白MT成功展示在酿酒酵母菌细胞外膜。研究酿酒酵母工程菌对铀、钍离子的吸附作用。结果表明，酸性条件下，酵母工程菌对铀离子的吸附，在铀离子初始浓度为50μg.mL-1，吸附体系最佳 pH值为4.0，在22℃条件下吸附20min既达到吸附平衡，最大吸附量达到16.36 mg.g-1；碱性条件下，酵母工程菌细胞对铀离子的最佳吸附 pH值为 pH7.0-9.0，最佳初始浓度为50μg.mL-1，在22℃条件下吸附30min既达到吸附平衡，最大吸附量达到16.30 mg.g-1；两种条件下对铀离子的吸附均在较短的时间内即可以达到平衡。相比之下，酵母工程菌细胞在最佳起始离子浓度250μg.mL-1、pH2.0条件下，对钍离子吸附速度更快，吸附容量更大，在22℃条件下吸附20min既达到吸附平衡，最大吸附量达到72.82mg.g-1。对实验数据分别进行了吸附动力学和吸附热力学拟合。结果表明，酿酒酵母细胞对铀、钍离子的吸附均符合Langmuir模型，说明此吸附基本为单分子层，吸附过程的主导是细胞表面功能基团与铀、钍离子的化学结合；酵母工程菌细胞对铀、钍离子的吸附也符合Freundlich模型，说明生物菌表面不是均一的，且吸附位点分布不均匀；动力学和热力学实验结果表明，酵母工程菌细胞对对铀、钍离子的吸附行为符合拟二级速率方程，吸附速率较快。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 生物吸附剂

1.2 生物吸附影响因素

1.3 生物吸附现状

1.4 金属硫蛋白及其应用

1.5 细胞表面展示技术的应用

1.6 本论文的研究目的和意义

1.7 本课题研究内容

2.1 主要实验仪器及试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

3.1主要实验仪器及试剂

3.2 酿酒酵母工程菌吸附材料的制备

3.3 标准曲线的绘制及测定方法

3.4 酸性条件下酿酒酵母工程菌对铀离子的吸附

3.5 碱性条件对铀离子的吸附

3.6 酿酒酵母工程菌对钍离子的吸附

3.7 研究性实验

第四章 共存离子对吸附的影响

4.1 铀、钍竞争性对吸附的影响

4.2 铼离子对吸附钍的影响

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

附录 攻硕期间以第一作者发表的论文