补体激活在三氯乙烯致敏小鼠肝脏损害中作用研究

摘要

研究背景：
　　三氯乙烯(TCE)是工业上广泛使用的一种有机溶剂,除了作为高分子化合物的原料以外,60％被五金、玩具、电子等行业用作金属部件和电子元件清洗剂,主要应用在清洗线路板,金属表面脱污去污,也常用作油脂、石蜡的萃取剂,还可用于印染油墨、斑点去污剂、打字改正液等。大量的临床病例显示DMLT患者除了全身性皮肤损害外,还伴有肝损伤,并且DMLT的致死主要原因是肝功能衰竭,因此肝脏损伤的机制研究在DMLT防治工作中显的尤为重要。但有相关研究还发现,TCE所致的药疹样皮炎,特别是免疫性肝脏损伤,不能用迟发型IV型变态反应完全解释。补体激活可能在TCE所致的免疫性肝损伤中也发挥一定的作用,提示在DMLT患者出现的肝功能损伤发生过程中除了IV型变态反应参与外,还可能有补体激活机制参与。
　　研究目的：
　　通过检测TCE致敏小鼠不同组别和时点小鼠血清和肝脏中补体活化产物C3a、C5a和C5b-9的表达水平,结合肝功能检查、肝脏脏器系数检查,探讨TCE致敏小鼠补体激活其与肝损伤的关系,最终阐明TCE的危害及其机理并制定防治对策提供理论依据。
　　研究方法：
　　选用6～8周健康雌性BALB/c小鼠75只,随机分成空白对照组、溶剂对照组、TCE处理组。建立BALB/c小鼠致敏模型,观察记录小鼠背部受试部位的皮肤致敏反应情况。根据末次激发24h后小鼠的致敏结果以及取材时点的不同(分别于末次激发后24h、48h、72h和7d采血,无菌取皮肤组织和肝脏组织),将TCE处理组分为致敏24h、48h、72h和7d组和未致敏24h、48h、72h和7d组。采用酶联免疫吸附法检测各组血清中C3a-desArg、C5a-desArg和C5b-9水平。免疫组织化学法检测肝脏组织中C3a、C5a和C5b-9的表达。直接免疫荧光法检测肝脏组织中的C5b-9表达。RT-PCR法检测肝脏组织中C3mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.致敏率在皮肤致敏反应试验中,空白对照组、溶剂对照组均未见红斑或水肿,TCE处理组63只小鼠中有23只背部皮肤出现不同程度的红斑和水肿,其余40只为未致敏组,致敏率达36.5%,致小鼠致敏强度为中度
　　2.肝功能及脏器系数检测结果
　　肝功能检测结果,空白对照组各指标与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂对照组24h、48h、72h、7d致敏组相比,AST明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应的未致敏组相比,24h、48h、72h、7d致敏组AST明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。ALT检查结果发现,空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);72h致敏组与溶剂对照组相比ALT明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应的未致敏组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。7d致敏组与溶剂对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
　　空白对照组与溶剂对照组相比,小鼠肝脏脏器系数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);然而,24h、48h、72h致敏组脏器系数显著高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05);同时点组间比较,致敏组的脏器系数均高于相应未致敏组,差异有统计学意义(P<0.05);且在末次激发后72h达到最高,24h、48h、72h致敏组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。
　　3.血清C3a-desArg、C5a-desArg和C5b-9水平
　　3.1.血清C3a-desArg水平:末次激发后,各组小鼠血清中C3a-desArg的水平,空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏组显著高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05);同时点相比较,致敏组的C3a-desArg水平均高于相对应未致敏组,差异有统计学意义(P<0.05);7d致敏组与溶剂对照组相比无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05)。且24h、48h、72h致敏组之间相比差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　3.2.血清C5a-desArg水平:末次激发后,各组小鼠血清中C5a-desArg的水平,空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏组显著高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05);同时点相比较,致敏组的C5a-desArg水平均高于未致敏组,差异有统计学意义(P<0.05);24h、48h、72h、7d致敏组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　3.3.血清C5b-9水平:末次激发后,各组小鼠血清中C5b-9的水平,空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏组显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与溶剂对照组相比,72h致敏组明显升高,同时点相比较,差异有统计学意义(P<0.05);72h致敏组的C5b-9水平均高于未致敏组,差异有统计学意义(P<0.05);且24h、48h、72h、7d致敏组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。
　　4.激发后肝脏组织中C3a、C5a和C5b-9的表达
　　4.1.C3a表达水平:空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。致敏24h、48h、72h组较溶剂对照组相比评分显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);其中致敏72h组表达最高,致敏24h、48h、72h组之间差异无统计学意义(P>0.05);然而致敏7d组C3a表达显著降低,与溶剂对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　4.2.C5a表达水平:空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。致敏24h、48h、72h、7d组较溶剂对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);其中致敏72h组表达最高,致敏24h、48h、72h组之间差异无统计学意义(P>0.05);然而致敏7d组C5a表达显著降低,与致敏72h组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　4.3.C5b-9表达水平:空白对照组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏组较溶剂对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);其中致敏72h组表达最高,致敏24h、48h、72h组之间差异无统计学意义(P>0.05)。同时点之间相比较发现,致敏24h、48h、72h组C5b-9表达水平分别高于未致敏24h、48h、72h组,差异有统计学意义(P<0.05)。7d致敏组与其未致敏组相比无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　5.免疫荧光法检测激发后肝脏组织中C5b-9的表达
　　我们对C5b-9在肝脏中的表达进行了更深一步的免疫荧光检测,24h、48h、72h致敏组可以看到明显的表达,并且在72h致敏组表达最高。
　　6.RT-PCR法检测C3mRNA表达情况
　　应用RT-PCR技术检测各组小鼠肝脏组织中C3mRNA表达情况,灰度值分析显示24h、48h致敏组与空白对照组、溶剂对照组、各自未致敏组相比C3mRNA表达明显增强(P<0.05),但是72h致敏组C3mRNA有明显的降低,差异有统计学意义(P<0.05),7d致敏组表达无统计学差异(P>0.05)。
　　结论：
　　1.TCE在一定剂量下能对小鼠致敏,致敏率为36.5%,TCE对BALB/c小鼠皮肤具有中度致敏作用。
　　2.TCE暴露可造成小鼠肝功能损伤和脏器系数的改变,72h组之前损伤程度随时间进行而加重。
　　3.TCE致敏小鼠体内补体系统可能被激活,且补体激活及其产物在TCE接触过敏性皮炎肝脏损伤发生过程中可能发挥重要的免疫调节作用。

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1. 前言

2、材料和方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.2 方法

2.2.1 动物饲养及分组

2.2.3 建立BALB/c小鼠致敏模型模致敏型：

2.2.4 视觉评分

2.2.5 体重及脏器系数测定

2.2.6小鼠血液、皮肤和肝脏组织的采集

2.2.7肝功能测定

2.2.8 血清中补体C3a、C5a和C5b-9的测定

2.2.9免疫组化法检测肝脏组织中补体C3a、C5a和C5b-9的表达

2.2.10 直接免疫荧光法检测肝脏组织中C5b-9的表达

2.2.11 RT-PCR法检测肝脏组织中C3 mRNA表达情况

2.3 统计方法

3、结果

3.1 小鼠致敏情况

3.2 肝功能及脏器系数检查结果

3.2.1 体重及脏器系数

3.2.2肝功能检测结果

3.3 小鼠血清C3a-desArg、C5a-desArg和C5b-9水平检测

3.3.1各组小鼠血清中C3a-desArg的水平

3.3.2各组小鼠血清中C5a-desArg的水平

3.3.3各组小鼠血清中C5b-9的水平

3.4 免疫组化法检测激发后肝脏组织中C3a、C5a和C5b-9的表达

3.4.1各组小鼠肝脏组织中C3a表达

3.4.2各组小鼠肝脏组织中C5a表达

3.4.3各组小鼠肝脏组织中C5b-9表达

3.4 免疫荧光法检测TCE激发后肝脏组织中C5b-9的表达

3.5 RT-PCR法检测C3 mRNA表达情况

4、讨论

5.结论

参考文献

个人简历

致谢

综述