光动力制备的皮肤鳞癌细胞裂解物对鼠树突状细胞表型及功能成熟的影响

摘要

背景：机体免疫系统对肿瘤细胞的生长有识别、监视和预防的功能,免疫系统启动对肿瘤细胞进行杀伤的重要环节之一是对肿瘤特异性抗原的识别和摄取,这个复杂的生理过程中树突状细胞(Dendritic cell,DC)起到了重要的作用。DC是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。正常生理情况下树突状细胞处于未成熟状态,低表达MHCⅠ/Ⅱ类分子、黏附分子和共刺激分子,但具有强大的抗原识别吞噬能力。在受到炎症因子等刺激后树突状细胞分化成熟,抗原递呈能力增强,将加工处理过的抗原肽-复合物呈递给T淋巴细胞,启动宿主的抗肿瘤免疫应答。近几年来,利用细胞因子在体外诱导培养大量树突状细胞技术的成熟,使得树突状细胞在肿瘤免疫疗法领域逐渐得到发展应用。5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-amininolevilinic acid-photodynamic therapy,ALA-PDT)是一种新型无创伤性治疗肿瘤等疾病的新技术,特别是对皮肤肿瘤疾病不仅可在组织学上实现逆转,而且能在不增加细胞毒性的情况下预防皮肤癌前期病变发生及降低皮肤癌发生概率。光动力疗法作用机制不仅包括直接对肿瘤细胞杀伤、损伤肿瘤组织脉管系统,而且能诱导机体抗肿瘤免疫应答。研究发现,肿瘤局部光动力治疗可以诱导局部或系统性抗肿瘤免疫反应,甚至远处转移病灶亦可受抑制。研究发现光动力治疗后肿瘤组织中有炎症细胞浸润和TNF-α,IL-1β,IL-6等炎症介质表达上调,且局部DC、CD4+T细胞、CD8+T细胞明显增多。不仅如此,文献报道光动力体外处理肿瘤细胞的得到的肿瘤细胞裂解物可作为一种新型的瘤苗对肿瘤起到治疗和预防作用,具体机制可能与细胞死亡过程中释放的肿瘤特异性抗原通过诱导DC分化成熟,启动机体抗肿瘤免疫反应有关,因此光动力诱导特异性抗肿瘤的效应逐渐受到了更多的关注。光动力疗法是一种光化学疗法,其诱导细胞死亡的方式与其他疗法(如放疗、化疗)有显著不同,且不同照光剂量光动力处理引起细胞的死亡方式(凋亡/坏死)也会有所不同。这种差异是否会影响肿瘤抗原释放的途径和程度,使DC不同程度分化成熟,影响DC对抗原的加工和递呈,最终造成强弱不等的免疫应答效应?目前国内外尚未发现这方面的研究报道,据此本实验重点探讨于体外光动力处理皮肤鳞癌细胞制备的细胞裂解物是否能对小鼠骨髓来源的树突状细胞表型及功能成熟的起到免疫调节作用,且这种调节作用强度是否与照光剂量存在量-效关系。为进一步提高光动力疗法免疫应答效应提供新的理论基础。
　　目的：通过观察小鼠骨髓来源的树突状细胞表型及功能变化,对光动力制备的皮肤鳞癌细胞裂解物影响DC免疫学效应进行研究。包括(1)不同照光剂量光动力处理的肿瘤细胞制备肿瘤细胞裂解物;(2)树突状细胞体外诱导、分离培养及鉴定;(3)观察细胞裂解物对树突状细胞免疫学指标变化影响。
　　方法：(1)选择诱导细胞凋亡、坏死状态下不同照光剂量光动力处理肿瘤细胞:选择小鼠皮肤鳞癌细胞株PECA,将PECA细胞与不同的浓度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM,10 mM)ALA无血清培养基避光条件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,测定生成的PpⅨ荧光强度。以PpⅨ荧光强度最强的点为最佳ALA浓度及孵育时间。在此基础上,以不同的照光剂量(0 J/cm2、5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2)ALA-PDT处理皮肤鳞癌细胞株PECA,采用Hoechst/PI染色及流式细胞术检测肿瘤细胞的死亡方式。(2)树突状细胞体外诱导培养及鉴定:于细胞因子IL-4、GM-CSF联合使用于体外分离诱导小鼠骨髓树突状细胞(Dendritic cell,DC),在倒置显微镜下每天观察细胞的生长情况,描述细胞的形态变化;在培养7天后分别采用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM)、扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM)观察细胞的形态;并利用抗小鼠 CD11c-PE抗体标记DC,流式细胞术鉴定DC纯度。(3)分析光动力制备的细胞裂解物对DC免疫学指标变化的影响:将制备的光动力细胞裂解物与树突状细胞共孵育24小时后,将DC细胞与细胞培养上清取出。分别采用ELISA法检测上清中DC分泌的IL-12、INF-γ、IL-10等细胞因子变化;采用流式细胞术检测DC表面标志分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等表达变化。最后采用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)观察DC体外对T淋巴细胞增殖作用的影响。
　　结果：(1)诱导细胞凋亡、坏死状态下不同照光剂量的确定:将 PECA细胞与不同的浓度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM,10 mM)ALA无血清培养基避光条件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,测定生成的PpⅨ荧光强度,选取0.5 mM ALA及5小时孵育时间为最佳组合。采用0 J/cm2、0.5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2不同剂量进行照射后,流式细胞术检测细胞凋亡率分别为1.5％、28.0%、11.9%、1.8%;坏死率分别为0.2%、1.0%、11.9%、34.8%。Hoechst/PI染色1.2%、30%、12%、2%。根据实验结果确定0.5 J/cm2照光剂量为诱导细胞凋亡状态的最佳剂量,2 J/cm2照光剂量为诱导细胞坏死状态的最佳剂量。(2)小鼠骨髓来源的树突状细胞分离诱导及鉴定结果:经细胞因子联合应用体外分离诱导,原代培养小鼠骨髓树突状细胞,经流式细胞术鉴定特殊表面标记CD11c-PE,纯度为80%左右。利用倒置相差显微镜、透射电镜、扫描电镜观察细胞形态变化并记录。(3)树突状细胞免疫学指标变化;不同光动力剂量处理的肿瘤细胞与DC共培养24小时后,ELISA检测不同剂量、不同时间点细胞裂解物与 DC共培养上清中的细胞因子INF-γ、IL-12、IL-10分泌量的变化。结果显示光动力处理细胞裂解物对DC致敏后,各组细胞因子释放量高于未致敏 DC组;0.5 J/cm2光动力剂量下分泌的细胞因子的量普遍最高,而2 J/cm2光动力剂量下分泌的细胞因子的量普遍最低;各个剂量下处理6小时细胞因子分泌量均为最高峰,其中在0.5 J/cm2光动力剂量下处理6小时后的细胞裂解物刺激DC释放到上清的各个细胞因子的分泌量为最高。在此基础上,我们重点研究0.5 J/cm2光动力剂量处理的细胞裂解物致敏DC后,流式细胞术鉴定DC表面标记性分子的表达变化,其中细胞裂解物致敏DC组CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达量均增加,增加的表达量小于LPS刺激DC组。混合淋巴细胞反应研究光动力处理细胞裂解物致敏树突状细胞体外对同种异型 T淋巴细胞的增殖作用,分别以0.5 J/cm2光动力剂量下处理3h,6h,9h,12h,24h细胞裂解物致敏的DC,再与同种异型T淋巴细胞共培养,观察DC对T细胞的刺激指数,其中6h组刺激增殖能力明显高于3h、9h,12h,24h组,且随着DC比例的增加增殖能力也随之增加。
　　结论：(1)光动力处理的肿瘤细胞裂解物能有效激活小鼠树突状细胞分化发育成熟;(2)在0.5 J/cm2光动力剂量下处理6小时后的细胞裂解物刺激DC免疫成熟能力最强,细胞裂解物对 DC免疫调节作用与光动力照光剂量存在一定的量-效关系。

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英文缩略词表

前言

参考文献

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5.讨论

6 结论

参考文献

第二部分 小鼠骨髓树突状细胞体外分离诱导培养

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5结论

参考文献

第三部分 致敏树突状细胞免疫学指标变化

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

课题综述

结语

参考文献