免疫原性裂解物制备方法、获得的裂解物、负载有该裂解物的树突状细胞以及药物组合物

摘要

本申请涉及免疫原性裂解物制备方法、获得的裂解物、负载有该裂解物的树突状细胞以及药物组合物。具体的，本申请涉及从间皮瘤肿瘤细胞制备免疫裂解物的方法，该裂解物和负载该裂解物的树突状细胞，本申请进一步涉及含有该裂解物或树突状细胞的药物组合物，裂解物的用途，所述负载的树突状细胞或所述药物组合物在预防或治疗间皮瘤中的用途。

说明书

本申请是申请号为201380073970.8的中国专利申请的分案申请，原申请是2013年12月20日提交的PCT国际申请PCT/EP2013/077837于2015年08月27日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及一种从间皮瘤肿瘤细胞中制备免疫原性裂解物的方法，如此获得的裂解物，以及负载有所述裂解物的树突状细胞。此外，本发明还提供了一种含有该裂解物或树突状细胞的药物组合物。而且，本发明还提供了所述裂解物、树突状细胞或药物组合物在预防或治疗间皮瘤中的应用。

背景技术

胸膜腔的恶性间皮瘤是一种高致命的肿瘤。从症状发作起，平均存活持续时间为9-15个月，预后较差。到目前为止，没有标准的根治性治疗(curative therapy)恶性胸膜间皮瘤(下称：间皮瘤)的手段。如胸膜切除术和胸膜外全肺切除术的手术方法会导致高的局部复发率和可疑的生存希望(questionable survival benefit)。唯一经美国食品和药物管理局(FDA)核准的治疗为培美曲塞(pemetrexed)(艾宁达Alimta)/顺铂，具有三个月的平均生存希望。由于目前治疗方式的有限成就，迫切需要新的治疗方案。利用免疫系统的特异性和效力的可能性成为了癌症免疫治疗中与日俱增的兴趣的基础。一种激活患者免疫系统的方法是使用树突状细胞来呈现肿瘤相关抗原，从而产生抗肿瘤特异性的应答。

树突状细胞是位于机体与它所处的环境的战略性位置的高运动性和非常有效的抗原呈递细胞。在这些位置，它们收集抗原并将抗原输送到二级淋巴器官，在这里，它们指导和控制自然杀伤细胞，B和T淋巴细胞的活化，并有效地激活它们以对抗抗原[1]。该属性使得他们成为对癌症的治疗策略中有吸引力的候选者[2-3]。树突状细胞可以在体外大量的产生，绕过由免疫抑制肿瘤环境引起的抗原呈递缺陷[4-7]，并随后以成熟状态注入以诱导抗肿瘤应答[8-11]。

已发现，基于树突状细胞的免疫疗法在实验动物和人类的某些癌症，比如肾细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤和肺癌中能够诱导保护性和抗肿瘤免疫性[12]。这在间皮瘤中也被证明。特别地发现，基于树突状细胞的免疫疗法在恶性间皮瘤的小鼠模型中的生存率和肿瘤生长的减慢上具有有益效果[13]。

基于这些在实验动物中的临床前发现，已启动临床试验来评估，在间皮瘤患者中，脉冲的树突状细胞诱导肿瘤特异性细胞毒性T细胞应答的安全性和可行性[14]。10例患者接受化疗(培美曲塞/顺铂)，然后进行三次自体肿瘤裂解物负载的单核细胞来源的树突状细胞的疫苗接种。如较早在小鼠中发现的那样，在接种树突状细胞疫苗之前化疗，以减少肿瘤负荷，从而潜在地增加接种的功效。从该研究中能够清楚的知道，在间皮瘤患者化疗后注射自体肿瘤裂解物负载的树突状细胞是安全和耐受性良好的。

但是，使用自体肿瘤细胞裂解物负载树突状细胞具有一定的理论和实际的缺点。与自体的途径相关联的一个关键问题是，来自于胸恶性肿瘤的切除肿瘤材料的肿瘤细胞，特别是间皮瘤(胸水或活组织检查)的数量是非常有限的。作为一个例子，第一次使用树突状细胞的基于免疫治疗间皮瘤的人临床试验中，大多数患者被排除参与[14]。在总数为57位的间皮瘤患者中，只有10例患者能提供足够的肿瘤材料，虽然所有患者在CT/MRI扫描中有高肿瘤负荷。

此外，从患有间皮瘤的患者获得的自体肿瘤材料在肿瘤总数上是非常不同的，并被其它细胞“污染”。这导致高度可变的肿瘤细胞裂解物，使得标准化非常困难。当这样的肿瘤材料被负载到自体树突状细胞时，表型和刺激能力的不同结果是可以预见的。此外，为每个单独的患者制备自体肿瘤材料是费时费力的。此外，还需要对每个病人的裂解物批次进行质量检测，使得基于自体肿瘤裂解物的树突状细胞的免疫治疗过程是非常昂贵的。

与使用自体间皮瘤肿瘤细胞相关联的另一局限是在体外操作肿瘤来源的细胞的难度。用以优化制备肿瘤细胞衍生物(凋亡或坏死碎片)、增加免疫原性或通过蛋白质分级富集、以及其他重要的以增加疗效的步骤的不同方法不能直接在肿瘤的自体材料上进行实施。离体培养自体细胞直到细胞数量足够用以操纵是不合适的，因为即使进行短期培养间皮瘤细胞，大多数也未能产生细胞系。另一个使用自体肿瘤细胞是不可行的原因是需要相对长的培养周期，而在此期间，患者的疾病会进一步发展。

在现有技术中，已有建议使用凋亡的同种异体间皮瘤肿瘤细胞用于负载自体树突状细胞。在这方面，参考了Ebstein等人2003年在American Journal of Respiration andCritical Care Medicine杂志上的文章。在本文中，将来源于一种细胞系的完整凋亡的、同种异体间皮瘤肿瘤细胞用于体外研究，其中自体树突状细胞负载有所述完整凋亡的肿瘤细胞。

虽然在本研究结果中表明，用过表达凋亡热休克蛋白的间皮瘤细胞培养树突状细胞以诱导细胞毒性T细胞应答，Ebstein的方法和所使用的细胞在临床上并不可用。Ebstein使用的细胞来源于一种细胞系，因而呈递给树突状细胞的抗原将是相对有限的，因此将严重降低其临床用途。这还可以通过以下事实例证：如果肿瘤细胞之前已经进行了热休克处理，使用的细胞系只表现出积极的结果。更重要的是，Ebstein使用的仅仅是用UV-B辐射诱导凋亡的完整的肿瘤细胞。因为许多细胞可以在这种UV-B辐射处理下存活，因此它们不适合给药于患者。在这方面可以参考查Chalmers A.H等人1976年在Cancer Research和Salucci S.等人2013年在International Journal of Molecular Sciences上的报道。

因此，仍然需要提供一种安全可靠的方法用于治疗间皮瘤患者，以及提供用于预防或治疗间皮瘤的用途的药物和药物组合物。

发明内容

本发明的第一个方面涉及一种用于制备免疫原性裂解物的方法，该包括以下步骤：

i)提供来自至少两种不同细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞；

ii)诱导肿瘤细胞的坏死或凋亡；

iii)裂解坏死或凋亡的肿瘤细胞，以获得裂解物。

在本发明的方法中，来自至少两种不同的细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞第一次被用于制备可用于免疫治疗具有间皮瘤增加风险的人群或患者的裂解物。

由于不同的抗原表达发生在患者不同的间皮瘤肿瘤细胞系中，因此，提供给患者负载有仅来自一种细胞系的树突状细胞是不足够的。相反，重要的是，用充足的肿瘤抗原来源来负载树突状细胞，以使得细胞毒性T细胞应答被诱导以抵抗种类繁多的间皮瘤肿瘤。

本发明中，这通过使用来自于至少两种不同的细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞裂解物负载树突状细胞来实现。通过使用不同的细胞系，因此，在裂解物中呈现出了大量的抗原，所述裂解物可以用于负载树突状细胞。这样一来，患者的间皮瘤肿瘤通过下调特定抗原来逃避的机会将减少。

此外，使用所述肿瘤细胞的裂解物来负载树突状细胞是本发明的本质。由于使用了肿瘤细胞的裂解物，可以获得更好的来自不同肿瘤细胞系的不同抗原的混合物。这样，负载着所述裂解物的树突状细胞可以呈递来自不同肿瘤细胞系的所有抗原。而这通过使用完整的细胞系(intact)是(同种异体肿瘤细胞)不可能实现的。使用裂解物的另一个优点是，它更容易大量生产，这更容易处理和包装，并且其质量可以被相对容易的监控。

在本发明的上下文中，术语“间皮瘤肿瘤细胞”是指来源于恶性间皮瘤的细胞。

在本发明的上下文中，术语“同种异体”具有其正常的科学意义，是指肿瘤细胞来源的个体与将根据本发明的方法获得的裂解物进行后续给药的个体不同。从同种异体间皮瘤肿瘤细胞来源的肿瘤细胞裂解物提供了更加标准化和简单的方法，绕过了需要单独制备自体肿瘤裂解物。它也提供了选择最佳的来源(凋亡或坏死)、剂量和呈递到树突状细胞或进行增加细胞免疫原性操作的机会。强大和有效的大规模生产过程的利用也要求较少的产品批次用以质量控制测试，如一致性(identitv)、纯度、数量和无菌/安全测试。相比于自体，同种异体途径的主要优点是，肿瘤细胞可以被优化，大容量存储，和及时制造/质量控制，由于供给已经存在，因此，不影响患者的直接疾病进展。

按照本发明，术语“坏死”具有其正常的科学意义，是指细胞的形态变化。坏死，例如，特别是以细胞膜的“泄漏”为特征，即，增加的渗透性，导致细胞的内容物外排和扰动细胞稳态和离子的平衡的物质的涌入，DNA片段化，最终产生来源于瓦解的细胞的粒状结构，例如细胞碎片。通常，坏死导致蛋白质分泌到周围环境，当在体内发生时，导致促炎反应。

测定细胞是否坏死的方法在现有技术中是已知的。本领域技术人员选择哪种方法并不重要，因为不同的方法是已知的。

根据本发明，坏死细胞可以被确定，例如，通过光、荧光或电子显微技术，使用例如台盼蓝的经典染色，凭借坏死细胞吸收该染料，因此被染成蓝色，或通过包括丧失膜完整性、细胞器的崩解和/或染色质的絮凝区的形态变化区分坏死细胞。其他方法包括流式细胞术，例如通过用碘化丙锭染色坏死细胞。

根据本发明，术语“凋亡”具有其正常的科学意义，是指程序性细胞死亡。如果细胞凋亡，细胞中会发生各种变化，如细胞皱缩、核破碎、染色质浓缩、染色体DNA片段化。

凋亡细胞可被确定，例如通过流式细胞术，例如使用膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)实现，用荧光：氟化钠红(Flura-red)，奎因-2(Quin-2)，7-氨基放线菌素D(7-AAD)，罗丹明123积累的减少，由核酸内切酶：TUNEL-方法(末端核苷酸转移引起的X-UTP缺口标记)检测的DNA片段化；通过用赫斯特(Hoechst)33258染料染色利用光学显微镜；通过免疫印迹(Western blot)分析，例如通过用特定的抗体标记89kDa产物检测细胞凋亡蛋白酶3(caspase 3)的活性，或者通过用特定的抗体标记检测细胞色素C的流出；或者利用特定DNA梯度，通过琼脂糖凝胶DNA分析对典型的DNA片段进行检测。

根据本发明，术语“裂解”涉及本领域用于打开/破坏细胞的公知的各种方法。原则上，任何可以实现裂解肿瘤细胞的方法都可以使用。适当的方法可以由本领域技术人员在现有技术中选择。例如，可以通过酶促、化学或物理的方法打开/破坏细胞。可用于裂解肿瘤细胞的酶和酶混合物的实例可以是蛋白酶，如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶。化学物质的非限制性的实例为例如尼格罗霉素(nigromycin)的离子载体，例如十二烷基硫酸钠的洗涤剂、酸或碱；和物理方法的非限制性的实例是例如弗氏压碎器(French pressing)的高压，摩尔渗透压浓度，温度如热或冷。裂解细胞的首选方法是使细胞冻融。另外，除了蛋白水解酶、酸、碱等，也可以使用合适的酶的组合。

根据本发明，术语“裂解物”是指含有通过裂解肿瘤细胞产生的细胞蛋白和因子的水溶液或悬浮液。这样的裂解物可以包括大分子，如DNA、RNA、蛋白质、肽、碳水化合物、脂类等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂质酸等，或来自裂解的细胞的碎片。存在于所述裂解物中的细胞碎片可以是平滑的或粒状的结构。优选地，所述水介质是水，生理盐水或缓冲液。

根据本发明的所述裂解物不限于裂解的坏死细胞。例如，由于处理的细胞的不同敏感性，或由于处理条件，如UVB辐射，裂解的凋亡细胞也可以形成裂解物或成为裂解物的一部分。

如本文所用的术语“裂解物”也包括从上述裂解物中获得的制剂或片段。这些片段可以通过本领域技术人员公知的方法获得，例如色谱法，包括，例如亲和层析、离子交换层析、大小排阻层析、反相层析和其它位于层析柱或分批法中的材料的层析，其它分级方法，例如过滤方法，例如超滤、透析、离心中尺寸排阻透析和浓缩、密度梯度或阶梯阵矩(stepmatrices)离心、沉淀，例如亲和沉淀，盐溶或盐析(硫酸铵沉淀)，醇沉淀，或其它蛋白质化学，分子生物学，生物化学，免疫学，化学或物理方法来分离上述裂解物的组分。在一种优选的实施方案中，优选那些比其他具有更强的免疫原性的片段。本领域的技术人员能够选择合适的方法，并通过上述的一般说明和本文实施例中的具体说明，如果有必要，并适当地修改或改变这些方法来确定其免疫原性潜力。

优选地，在肿瘤细胞中诱导坏死或凋亡之前，将间皮瘤肿瘤细胞的免疫原性增强。这种免疫原性的增加可以通过在41.2℃或更高温度下孵育同种异体肿瘤细胞1-120分钟，优选20-50分钟，最优选约30分钟来实现。另一种增加肿瘤细胞的免疫原性的方法是通过将肿瘤细胞暴露于氧化修饰，例如将细胞暴露于次氯酸或过氧化氢中来实现。同种异体肿瘤细胞的免疫原性也可通过将细胞暴露于组蛋白脱乙酰酶抑制剂，如丙戊酸或辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid)中，或通过将肿瘤细胞暴露于DNA甲基转移酶抑制剂，例如5-氮杂-2-脱氧胞苷中来增强。

间皮瘤肿瘤细胞，优选脊椎动物，更优选来自哺乳动物，最优选来自人类。

为了获得很好的免疫原性应答，优选使用来自至少两种间皮瘤肿瘤细胞系，优选至少三种间皮瘤肿瘤细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞的混合物制备裂解物。当至少五种间皮瘤肿瘤细胞系的混合物用于制备裂解物时，可以获得特别好的结果。使用所述细胞系的混合物作为肿瘤裂解物的来源对提供肿瘤相关抗原的更广泛的抗原谱(多种潜在的肿瘤抗原)是有利的，这将增加识别和破坏肿瘤细胞的免疫应答的能力，因为通过调节抗原表达来逃避免疫监视的机会更受限制。

优选地，至少一种使用的细胞系来源于具有如下免疫结构的肿瘤组织样本：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

由于存在相对高数量的CD3阳性和CD45RO阳性细胞，很显然，肿瘤组织样本已经处于CD3

此外，由于相对低数量的FoxP3阳性细胞和CD206阳性细胞，显然，高浸润的调节性T细胞和M2巨噬细胞并没有发生。这也与较高的生存率相关。来源于这类肿瘤组织样本的间皮瘤细胞系因而显示出高的免疫刺激，即，它们提供足够量的抗原，而它们引发较小的调节性T细胞应答。在这方面，参考了Fridman等人2012年在Nature Reviews Cancer和Galon等人2013年在Pathology杂志上的报道。

鉴于上述情况，因此在免疫治疗中优选使用从这样的细胞系制备的裂解物，尤其是用于脉冲树突状细胞。从这些肿瘤细胞制备的裂解物含有激活免疫系统的抗原，而肿瘤衍生抑制因子被限制。

根据本发明，特别优选的，使用至少两种这样的细胞系用以制备裂解物。

在本发明的上下文中所用的术语“免疫结构”(immune contexture)在此具有其常规含义，指的是在(人)肿瘤样本中不同的免疫细胞群的密度。

不同的免疫细胞的密度典型地通过样品的组织学染色来确定。关于CD3、CD45RO、FoxP3和CD206的用于组织学染色免疫细胞的方法是公知的现有技术。在这方面参考了Fridman等人2012年在Nature Reviews Cancer中的报道，该文献通过引用并入本文。

在本发明的方法中使用的同种异体间皮瘤肿瘤细胞，是在例如培养瓶中培养。由于这样的事实，这些同种异体细胞具有以最小损失他们免疫原性的方式而无限分裂的能力，相比非癌性细胞，它们适合用于制备裂解物。

目前已经开发了6种具有特别好的结果的人类间皮瘤细胞系。这些细胞系已经保藏在德国的“Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen”中，下文简称为DSMZ。细胞系分别给予了下列代码和登录号：Thorr 01(保藏号DSM ACC3191)，Thorr02(保藏号DSM ACC3192)，Thorr 03(保藏号DSM ACC3193)，Thorr 04(保藏号DSMACC3194)，Thorr 05(保藏号DSM ACC3195)，Thorr 06(保藏号DSMACC3196)。所述保藏是根据布达佩斯条约的条款，按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏进行的。

细胞系Thorr03和Thorr02特别值得注意。这些细胞系来自显示出相对高的CD3

根据本发明，优选三种，更优选五种，最优选所有这些细胞系用于制备裂解物。特别优选使用至少所述Thorr03和Thorr02细胞系用于制备根据本发明的裂解物，因为在患有间皮瘤的患者中，这些细胞系显示了非常高的T细胞免疫刺激。因此，这些肿瘤细胞表达激发免疫系统对肿瘤应答的特异性抗原。这些抗原存在于裂解物中，当负载到树突状细胞后刺激T细胞的抗肿瘤应答。

同种异体间皮瘤肿瘤细胞的坏死，可以通过现有技术中公知的方法来实现。然而，特别优选的是将细胞循环冻融。优选地，通过在-70℃以下的温度冷冻并在超过30℃的温度解冻，特别是优选在-75℃以下的温度冷冻并在超过35℃的温度解冻，最优选在-80℃以下的温度冷冻并在超过37℃的温度解冻，以使细胞坏死并裂解。还优选，所述冷冻/解冻重复至少1次，更优选至少2次，甚至更优选为至少3次，特别优选为至少4次，最优选至少5次。

优选肿瘤细胞用至少50Gy辐射，优选至少100Gy辐射进行处理。这种方式避免了任何肿瘤细胞保持存活。所述辐射处理可以在肿瘤细胞经受冷冻和解冻之前或之后进行。

在同种异体间皮瘤肿瘤细胞中诱导凋亡可能是有利的。这可以通过使肿瘤细胞处于至少15kJ/m

为了确保所述肿瘤细胞不再存活，优选将坏死或凋亡的肿瘤细胞的裂解物进行至少50Gy，更优选100Gy的电离辐射。进一步优选在辐照之前或之后离心裂解物。

本发明的第二个方面涉及一种通过上述方法获得的裂解物。来自两种或多种不同的间皮瘤细胞系的，基于同种异体间皮瘤肿瘤细胞的裂解物尚未见报道。

具体地，从至少三种同种异体间皮瘤肿瘤细胞系，优选至少四种，更优选至少五种不同的同种异体间皮瘤肿瘤细胞系的混合物制备的裂解物尚未见报道。使用来自这种混合物的裂解物是有利的，因为它们提供更广泛的肿瘤相关抗原的抗原谱(多种潜在的肿瘤抗原)，这将增加识别和破坏肿瘤细胞免疫应答的能力，因为通过调节抗原表达来逃避免疫监视的机会是有限的。

特别优选地，细胞裂解物是从以下两种或多种人细胞系制备，这些人细胞系已保藏在DSMZ中。所述细胞系分别给予下列代码和登录号：Thorr 01(保藏号DSM ACC3191)，Thorr 02(保藏号DSM ACC3192)，Thorr 03(保藏号DSM ACC3193)，Thorr 04(保藏号DSMACC3194)，Thorr 05(保藏号DSM ACC3195)，Thorr 06(保藏号DSM ACC3196)。

特别优选使用至少细胞系Thorr03和Thorr02用于制备根据本发明的裂解物。

该保藏根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约的条款进行。优选三种、更优选五种、最优选所有这些细胞系被用于制备根据本发明的裂解物。

利用来自同种异体间皮瘤肿瘤细胞的肿瘤细胞裂解物，还提供了更加标准化的裂解物，绕过了单独制备自体肿瘤裂解物的需求。

与自体相比，同种异体方法的主要优点还在于，肿瘤细胞的细胞可以被优化，大容量的存储，和制造/实时质量控制，由于供给已存在，不会对患者的直接疾病发展造成影响。

含有这种裂解物的所期望的容器可以从市场上购得。用于裂解物的合适的容器是密封容器如安瓿或囊(sachette)，优选指示活性剂的量。当组合物通过输液给药时，其可以使用含有无菌医药用水或盐水的输液瓶进行分装。当组合物通过注射给药时，可以使用含有注射用无菌水或盐水的安瓿，使得成分可以在给药前混合。裂解物也可配制成药物组合物，这将在下面更详细地描述。

本发明的第三个方面涉及一种负载(脉冲)有上述裂解物的树突状细胞。

根据本发明，术语“树突状细胞”具有其常规的含义，是指具有捕捉抗原和迁移到淋巴结和脾脏的能力的抗原呈递细胞，在淋巴结和脾脏它们被特殊活化以呈递加工后的抗原给T细胞。术语“树突状细胞”还包括与树突状细胞具有类似活性和功能的细胞。树突状细胞可来源于淋巴或单核吞噬细胞谱系。这样树突状细胞可以在淋巴和非淋巴组织中找到。后者仅当被激活并迁移到淋巴组织时，似乎才能够诱导T细胞应答。

已知树突状细胞是免疫应答的最有效的活化剂和调节剂，或其中之一。一个重要的特点是，它们是目前唯一知道的刺激未成熟

树突状细胞可以通过使用本领域技术人员公知的方法[14-17]从个体，优选人获得。在获得树突状细胞后，对它们进行培养以获得更多的树突状细胞。优选地，培养的树突状细胞是自体树突状细胞。使用自体树突状细胞的优点是，可以避免患者对这些树突状细胞的免疫反应，而针对存在于裂解物中的、来自间皮瘤肿瘤细胞的抗原的免疫反应被触发。

尽管使用自体树突状细胞具有许多优点，但是使用同种异体树突状细胞也是有利的。使用自体树突状细胞的一个主要优点是，可以提供给患者随时使用的药物。换句话说，不必收获、培养并负载来自个体的树突状细胞，而可以立即给药负载的同种异体树突状细胞。这样可以节省患者的宝贵时间。

可以使用适当的生长因子和/或细胞因子，例如GM-CSF和IL-4以对树突状细胞或其前体进行分化，所获得的未成熟树突状细胞负载根据本发明的裂解物。负载有根据本发明的裂解物的未成熟树突状细胞进一步熟化至成熟树突状细胞。在特殊情况下，成熟树突状细胞也可以负载(脉冲)来自裂解物的抗原或免疫原。

优选地，相对于每当量的树突状细胞，所述树突状细胞负载有至少0.1当量的肿瘤细胞，优选至少0.2当量的肿瘤细胞，更优选至少0.5当量的肿瘤细胞，最优选至少1当量的肿瘤细胞。

所使用的树突状细胞优选来自脊椎动物，优选来自哺乳动物，最优选来自人类。

本发明的第五个方面涉及含有根据本发明的裂解物的药物组合为，或涉及含有负载有根据本发明的裂解物的树突状细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及含有如上文描述的细胞裂解物或负载有所述裂解物的树突状细胞的药物组合物。这样的药物组合物含有治疗有效量的本发明的细胞裂解物或树突状细胞，和药学上可接受的载体。

优选地，给药至患者的所述组合物的剂量包括1×10

如本文所述，所述药物组合物可以与生理学上可接受的载体一起给药至患者。术语“载体”是指与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂、或运载体。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，优选的载体是水。盐水溶液、葡萄糖(dextrose)水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要的话，该组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

这些药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。所述组合物可以配制成栓剂，具有传统的粘合剂和载体例如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中有所描述。这样的组合物将含有治疗有效量的细胞裂解物，优选以纯化的形式，以及合适量的载体，以便提供适当的给药至患者的形式。制剂应当与给药模式相适合。

在另一个优选的实施方案中，按照常规适用于静脉内给药至人类的药物组合物的程序配制药物组合物。典型地，用于静脉内给药的组合物是以无菌等渗含水缓冲液形式的溶液。在必要时，所述组合物还可以含有增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，各成分以单位剂型单独或混合在一起给药，例如，作为在密闭容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩物，所述密闭容器例如为指示活性剂的量的安瓿或囊。当所述组合物通过输液给药时，其可以使用含有无菌医药用水或盐水的输液瓶进行分装。当所述组合物通过注射给药时，可以提供含有注射用无菌水或盐水的安瓿，使得成分可以在给药前混合。

本发明的细胞裂解物可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与例如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的阴离子形成的盐，以及与例如选自由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的阳离子形成的盐。

制剂中使用的细胞裂解物或负载的树突状细胞的精确剂量将取决于给药的途径和疾病的状态，并且应该根据医师的判断和每个患者的情况来决定。

优选地，将药物组合物配制成例如适合作为疫苗发挥作用的形式。用于制造根据本发明的疫苗组合物的形式或方法没有特别的限制，并且期望的形式的组合物可以通过应用本领域可用的单一方法或适当结合的方法来制备。为了制备疫苗组合物，可以使用本领域可用的含水介质，诸如注射用蒸馏水和生理食盐水，以及一种或多种药物添加剂。例如，可以使用缓冲剂、pH调节剂、溶解助剂、稳定剂、镇痛剂、防腐剂等，以及本领域技术人员所熟知的它们的特定成分。该组合物也可以制备为固体制剂如冻干制剂，然后通过在使用前加入增溶剂如注射用蒸馏水以制备为注射剂。根据引入的方式，所述化合物可以以下面所讨论的各种方式来配制。在制剂中的治疗活性化合物的浓度可以约为0.1-100重量％。

根据本发明的药物组合物可以单独给药或与其他治疗方法组合施用，例如辐射或其它化学治疗剂或抗癌剂，如治疗有效量的氮芥烷基化剂、亚硝基脲、烷基磺酸盐、替莫唑胺

在一种优选的实施方式中，所述组合物是可溶于水的形式，如药学上可接受的盐，这意味着包括酸和碱加成盐。

该组合物可以制备成各种形式，如注射液、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液等。

适用于口服和局部使用的药用级有机或无机载体和/或稀释剂可用于制备含有所述治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括含水介质，植物和动物油以及脂肪。稳定剂、湿润剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、或用于确保适当的pH值的缓冲剂以及皮肤渗透增强剂可用作辅剂。所述组合物还可以包括一种或多种下列物质：载体蛋白如血清白蛋白；缓冲剂；填充剂如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；粘合剂；甜味剂和其他调味剂；着色剂；和聚乙二醇。添加剂是本领域公知的，并且在各种制剂中使用。

正如所述的，根据本发明的药物组合物，或根据本发明的裂解物或树突状细胞，优选的，所述药物组合物可以与佐剂组合使用。

对于本发明，术语“佐剂”是指可以改变抗原诱导免疫应答的天然能力，并且特别地，通过将其改变或通过将其混合，或用另一种物质负载如上所述的树突状细胞来提高。术语“佐剂”也指产生裂解物的肿瘤细胞和/或被基因修饰的以表达佐剂或其他例如共刺激因子的影响免疫应答因子的树突状细胞。用于增强免疫应答的过程或物质被称为佐剂。至少三类佐剂已被长时间使用；这些是矿物油乳剂、铝化合物和表面活性物质，例如皂甙、溶血卵磷脂、视黄醛、奎尔A.RTM(Quil A.RTM.)，一些脂质体和普朗尼克聚合物制剂(pluronicpolymer formulations)。参见，例如，由William E.Paul，编辑，纽约Raven出版的基础免疫学(Fundamental Immunology)的第1008页(这本书将在下文被称为“基础免疫学”)。单独或组合使用的铝佐剂包括氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝和含有铵明矾(如(NH

制备用于注射的佐剂-抗原制剂在现有技术中是众所周知的。参见，例如，TerryM.Philips，Analytical Techniques in Immunochemistry，pp.307-10，Marcel Dekker，New York，1992。其它佐剂包括完全弗氏佐剂(一种油包水乳液，其中死亡的、干燥的分枝杆菌-常常是结核分枝杆菌-在油相中悬浮)；不完全弗氏佐剂(类似于不带分支杆菌的完全弗氏佐剂)；ISCOM(或含有由胆固醇、磷脂和皂苷Quil A.RTM的自发结合形成的亲脂性颗粒的免疫刺激复合物)；脂多糖(由脂质芯-脂质A-与某些杆菌组分的多糖侧链组成的复杂分子，脂质A结合到细菌的外膜和胞外多糖组分上。它们的佐剂功效与脂质A相关；它们还促进小鼠B淋巴细胞的有丝分裂)；和分枝杆菌佐剂(热处死、干燥的分枝杆菌全部，如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，费雷分枝杆菌(M.phlei)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis))，当它们被悬浮在矿物油和乳化剂时，对于与其在一起的任何抗原均具有佐剂的活性。

一些分枝杆菌提取物，例如分枝杆菌肽糖脂(peptidoglycolipids)具有类似的佐剂活性。参见，Dictionary ofImmunology at pp.3，7，46，94，97，105和116；R.B.Luftig，Microbiology and Immunology，pp.228-29，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia 1998。微生物佐剂包括短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，参见，例如Handbook of Immunology at 115-16。使用具有佐剂活性和作用的可能位点的控释制剂和材料在Fundamental Immunology at pp.1007-09中有所描述。矿物载体如氢氧化铝，硫酸钾铵和硫酸铝钾将抗原吸附在其表面上。这些常见的佐剂使用0.1％的浓度和在1mi中高达1mg的蛋白质抗原，以0.2-0.5mu/(kg体重)的剂量给药至动物。参见Miroslav Ferencik，Handbook of Immunochemistry，p.115，Chapman&Hall 1993(这本书将在下文中简称为“Handbook of Immunochemistry”)。尽管弗氏佐剂是有毒的，且不用于人类的免疫，但矿物佐剂如氢氧化铝在人类医学中是常见的，ld的116页。除了明矾，惰性载体组的其他佐剂包括膨润土、乳胶和丙烯酸颗粒。参见FundamentalImmunology的1008页。佐剂的组合也可具有佐剂性质。例如，已经表明，皂素和溶于角鲨烯的胞壁酰二肽的组合的水乳液作为佐剂用于诱导小鼠中某些反应的作用优于明矾，R.Bomford，M.Stapleton，S.Wilson，A.McKnight和T.Andronova，The control of theantibody isotype responses to recombinant human immunodeficiency virus gp120antigen by adjuvants，AIDS Res.Hum.Retroviruses Vol.8(1992)pp.1765et seq。这些佐剂由在过去十五年内已经开发出来的新的佐剂所补充。参见，在Vaccine Design中的Anthony C.Allison，The Role of cytokines in the Action of ImmunologicalAdjuvants。由Gregory Gregoriadis和Brenda McCormack编辑的The Role of cytokineNetworks，NATO ASI系列A：Life Sciences Vol 293，pp.1-9，Plenum Press，New York1997(该书籍以下将被称为“Vaccine Design”)；Immunology，116页；H.Snippe，I.M.Fernandez和C.A.Kraaijeveld，Adjuvant Directed Immune Specificity at theEpitope Level.Implications for Vaccine Development。在Vaccine Design中的AModel Study Using Semliki Forest Virus Infection of Mice，at pp.155-73。

佐剂可以在给药所述抗原之前、同时或以后给药。由佐剂引起的抗体增强产生的原因尚不完全清楚。然而，单独存在或以各种组合存在的佐剂的特性(允许物质或制剂作为佐剂活性被描述)已经被定义。参见，例如，J.C.Cox和A.R.Coulter，Adjuvants--Aclassification and review of their modes of action，Vaccine Vol.15(1981)pp.248et seq.；John Cox，Alan Coulter，Rod Macfarlan，Lorraine Beezum，John Bates，Tuen-Yee Wong and Debbie Drane，Development of an Influenza-ISCOM.TM.Vaccine，in Vaccine Design at pp.33-49。这些特性中的一种能够遗传给下一代，因此，所述疫苗在临近的剂量位点被保留以给予短期的缓慢释放(trickle release)或长期的脉冲释放(pulsed release)，Id.在34页。

优选地，所述药物或疫苗组合物直接给药，或与此处上面提及的佐剂或负载到抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞上组合给药。还优选的，所述药物或疫苗组合物都与佐剂，以及药物或疫苗组合物与负载的树突状细胞同时给药或彼此单独给药，例如在不同时间点或在不同的位置。

此外，还优选所述药物组合物和佐剂与负载到所述树突状细胞的药物组合物一起给药。由于树突状细胞是非常专业的抗原呈递细胞，在启动和调节抗原特异性反应中具有独特的能力，优选将其与本发明的药物组合物结合。

本发明的第六个方面涉及一种用于治疗或预防间皮瘤的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

i)提供来自至少两种不同的细胞系的同种异体间皮瘤肿瘤细胞，并制备它们的裂解物；

ii)制备树突状细胞；

iii)用所述肿瘤细胞的裂解物负载树突状细胞。

药学上可接受的载体可以在裂解物负载到树突状细胞上之前、期间或之后加入。然而，裂解物本身或树突状细胞的培养基可以被认为是药学上可接受的载体。

优选地，在上述方法中使用的裂解物是如前段所述的方法制备的裂解物，即从坏死或凋亡的间皮瘤肿瘤细胞得到的裂解物。

待负载裂解物的树突状细胞可以是自体的或异体的。然而，优选使用自体的树突状细胞。进一步优选负载未成熟的树突状细胞，尽管也可以使用成熟的树突状细胞。

根据本发明的裂解物、负载的树突状细胞和其药物组合物可用于治疗患有间皮瘤的患者，或可以给药至具有增加的发展间皮瘤机会的人。

根据本发明的裂解物、负载的树突状细胞和药物组合物可以与治疗效应量的其他药物活性化合物如氮芥烷基化剂、亚硝基脲、烷基磺酸盐、替莫唑胺

进一步优选的是，患者每次接种1×10

优选地，相对于每当量的树突状细胞，这些树突状细胞包括至少0.1当量的肿瘤细胞，更优选至少当量的0.2肿瘤细胞，甚至更优选0.5当量的肿瘤细胞，最优选至少1当量的肿瘤细胞。

特别优选至少两次，更优选至少三次，并且最优选至少五次进行这些剂量的剂型。特别优选地，给药至需要这些剂型的患者3次1×10

通过下列非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

本发明的最后一方面涉及以下人类细胞系：Thorr01(保藏号DSM ACC3191)，Thorr02(保藏号DSM ACC3192)，Thorr03(保藏号DSM ACC3193)，Thorr04(保藏号DSMACC3194)，Thorr05(保藏号DSM ACC3195)，Thorr06(保藏号DSM ACC3196)。这些细胞能够不失去其抗原性质地分裂。

附图说明

图1：示出了基于同种异体DC的免疫治疗表明，相比于未处理的小鼠，处理的小鼠的存活率增加。

图2：示出了在间皮瘤中的肿瘤免疫简况。

具体实施方式

实施例

实施例1(同种异体肿瘤裂解物)

鼠间皮瘤模型中，已经进行了实验，以通过用同种异体肿瘤裂解物负载(脉冲)树突状细胞以产生肿瘤特异性免疫。对在此研究中使用的小鼠注射自体AB1间皮瘤细胞系，以使得从这些细胞中发展出间皮瘤。在两个独立的实验中，对每组至少4只的小鼠在每种条件下进行了测试。

树突状细胞(DC)从具有特定生长因子的骨髓来源的单核细胞产生。为了从健康BALB/c或CBA/j供体小鼠获得骨髓，收集股骨和胫骨，破碎并用酒精冲洗。加入培养基并将细胞用100μm的膜过滤。然后加入(2mL)渗透裂解缓冲液，以除去红细胞，然后进行细胞计数。我们使用100-mm的培养皿，每个培养皿中有10×10

然后用同种异体(allogeneous)肿瘤细胞裂解物刺激未成熟树突状细胞(iDC)。为了负载iDC，相对于每当量的iDC，肿瘤裂解物以每3当量的肿瘤细胞的比率加入。AC29细胞系来源的肿瘤裂解物从每毫升PBS中悬浮有50×10

将细胞悬浮液在液氮中冷冻，并通过四个周期的冻融，接着使用超声波匀浆器(Soniprep)150超声破碎仪(Sanyo Gallenkamp BV，Breda，Netherlands)在冰上以10微米的振幅在10秒内超声处理四次来使其瓦解。该步骤用于未处理和热+UV处理的肿瘤细胞，以产生坏死和凋亡的肿瘤细胞裂解物。肿瘤细胞裂解物储存在-80℃直到使用。

将来自于BALB/c和CBA/j小鼠的iDC的细胞培养物和AC29的肿瘤细胞裂解物在37℃保持8小时。8小时后，将100μg/ml的脂多糖(LPS)[大肠杆菌026：B6，Sigma-Aldrich公司]加入到DC培养物中，在37℃孵育过夜以使其完全成熟。第二天，通过加入PBS温和吹打将DC从培养皿中分离，从而收集DC。将DC在PBS中洗涤，并在Varifuge 3.OR离心机(Heraeusintstruments)中、4℃下，以400×g离心7分钟，并再悬浮于2ml PBS中。然后，使用3毫升淋巴细胞-哺乳动物(Cedarlane，Hornby，ON，Canada)密度梯度离心从肿瘤细胞裂解物和碎片中分离和纯化DC。然后，在室温下，1200×g(Heraeus Instruments)离心20分钟后，使用移液管从界面收集DC。再次在4℃、PBS中以400rpm离心7分钟洗涤细胞。将细胞以500μL的PBS中具有3×10

在致死肿瘤注射(保护设置)14天和7天前或肿瘤注射(治疗设置)后1天和8天后，将负载有AC29细胞裂解物的树突状细胞腹膜内注射到BALB/c或CBA/j小鼠。每组/条件使用至少4只小鼠。对肿瘤的生长、体重、身体健康和存活情况进行两个月的测定。收集存活小鼠的脾和肿瘤材料，并通过流式细胞术(粒酶B和IFN-γ阳性细胞)在铬释放分析中分析它们的细胞溶素活性。

如图1所示，基于同种异体DC的免疫治疗表明，相比于未处理的小鼠，处理的小鼠的存活率增加。相比于未处理的小鼠，在同种异体DC处理的小鼠中，除了增加的CD8阳性细胞毒性T细胞的数量，每个细胞产生IFN-γ和粒酶B的比例也提高了。当细胞与铬标记的AC29肿瘤细胞共培养时，从“同种异体”处理的小鼠来源的脾细胞的杀伤能力大大增加了。

实施例2：(自体肿瘤裂解物)

按照上述的关于所述同种异体肿瘤裂解物的相同的方案，制备自体肿瘤裂解物，例如AB1小鼠间皮瘤细胞系。用于制备裂解物(即AB1细胞系)的间皮瘤细胞系与用于在小鼠中诱导间皮瘤的细胞系相同。因此，裂解物被认为是自体的。同样，相比未处理的小鼠，经处理的小鼠显示出提高的存活率。

用自体肿瘤细胞裂解物(AB1)负载的树突状细胞处理的小鼠与用同种异体肿瘤细胞裂解物(AC29)负载的树突状细胞处理的小鼠的存活率是可比的。在每个实验的至少4只小鼠中，对每种条件进行了测试。每个实验进行两次。

实施例3优选的细胞系Thor01至Thorr06的起源

恶性间皮瘤的特征在于独特的肿瘤-和免疫特性。有明显的异质性和免疫浸润(immune infiltration)到与淋巴结参与和肿瘤行为(侵略性的、攻击性的、温和的和惰性的)相关的个性。有4种可能的基于免疫激活和免疫抑制之间平衡的免疫肿瘤学特性。作为本发明要求保护的细胞系Thorr01-06来自肿瘤组织，至少一种细胞系来自4种免疫肿瘤学特征之一。产生细胞系的肿瘤的特征如下所示：

来自于间皮瘤肿瘤组织的Thorr01细胞系具有：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

来自于间皮瘤肿瘤组织的Thorr02细胞系具有：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

来自于间皮瘤肿瘤组织的Thorr03细胞系具有：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

来自于间皮瘤肿瘤组织的Thorr04细胞系具有：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

来自间皮瘤肿瘤组织的Thorr05和Thorr06细胞系具有：

-每mm

-每mm

-每mm

-每mm

因此，从两种或多种所述细胞系制备用于负载树突状细胞的裂解物是有利的。选择至少两种细胞系，但优选至少四种细胞系，四种中的一种(one out of each quadrant)提供所有不同的间皮瘤免疫-肿瘤特性，以用于肿瘤相关抗原(TAA)来源的最广泛抗原性变异。在患者接种疫苗后，这些TAA都被离体自体DC吸收，然后在适当的MHC等位基因背景下，呈递给T细胞。

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