HCN2基因修饰的骨髓间充质干细胞源性起搏细胞的变时性相关受体的研究

摘要

背景：
　　心律失常是常见的心血管疾病，不仅影响人们的生活质量，而且是心脏性猝死最常见的原因。心脏电子起搏器植入是针对缓慢性心律失常、恶性室性心律失常的一种有效的干预措施和重要的治疗方法，但从心脏的生理功能和人体适应性的角度看，心脏电子起搏器治疗仍存在非生理性起搏等问题。用生物学方法重建具有自律性的生物活性细胞即“生物起搏器”是近年热点研究课题。一些研究表明，用超极化激活的环核苷酸门控（HCN）基因家族修饰的干细胞可以产生超极化激活的阳离子电流（If），其中HCN2和HCN4亚型在心脏窦房结细胞中的表达最为丰富。理想的生物起搏器不仅要有自律性，还应具有类似窦房结起搏细胞对交感神经和副交感神经调节作出反应的变时性能力。然而，关于用HCN2或HCN4基因修饰的干细胞是否具有变时性能力的研究甚少。肾上腺素能受体β1（Adrb1）和胆碱能受体M2（Chrm2）作为交感神经和副交感神经的受体，是心脏变时能力的分子基础，细胞表达Adrb1和Chrm2是具备变时性能力的生物学前提。
　　目的：
　　本研究探讨在心肌细胞共培养微环境下HCN2基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）表达变时性相关受体Adrb1和Chrm2的情况。
　　方法：
　　利用基因拼接技术和DNA重组技术，选用真核绿色荧光质粒载体pEGFP-C1和小鼠的起搏基因mHCN2在体外构建pEGFP-C1-mHCN2重组质粒，然后导入BMSCs，在特定环境下诱导定向分化为成熟的功能细胞。选取ICR乳鼠提取原代心肌细胞在37℃、5%的CO2培养箱中进行培养，选取4周雄性ICR小鼠提取BMSCs经流式细胞仪筛选鉴定后分为四组进行实验，第一组为转染pEGFP-C1-mHCN2质粒并与心肌细胞共培养48h的BMSCs（TF+CO组），第二组为单纯转染pEGFP-C1-mHCN2质粒培养48h的BMSCs（TF组），第三组为单纯与心肌细胞共培养48h的BMSCs（CO组），第四组为培养48h未进行任何处理的BMSCs（CTL组）。经pEGFP-C1-mHCN2转染成功的细胞在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光。分别提取四组培养的BMSCs蛋白及RNA，通过蛋白质印迹法（Western blot）和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）来检测mHCN2通道的表达情况及Adrb1和Chrm2相关mRNA表达情况。心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达可以通过胶体金免疫层析法（GICA）测定。
　　结果：
　　①在荧光显微镜下观察到TF和TF+CO组BMSCs的绿色荧光，表明两组BMSCs转染了mHCN2基因，且重组质粒能在转染的细胞中进行自我复制、转录和翻译。
　　②蛋白质印迹结果显示HCN2通道蛋白在TF+CO和TF组中成功表达。
　　③CO和TF+CO组检测到cTnI的浓度，表明两个实验组的BMSCs可表达心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白I。
　　④TF+CO和TF两组Adrb1和Chrm2 mRNA的表达量均高于CTL和CO组（P＜0.05），并且，TF+CO组mHCN2和Chrm2 mRNA的表达显著高于TF组（P＜0.05）。
　　结论：
　　pEGFP-C1-mHCN2转染的BMSCs可成功表达mHCN2通道蛋白。与心肌细胞共培养条件下可诱导基因修饰的BMSCs表达心肌细胞特异性标志物（cTnI），并进一步促进修饰的BMSCs表达mHCN2通道蛋白、Adrb1和Chrm2。这些研究结果为干细胞源性起搏细胞具备变时性功能的生物学基础提供了理论依据，为未来治疗缓慢性心律失常提供了新的思路。

目录

声明

英文缩略词表（Abbreviation）

1. 前言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 数据分析

3. 结果

3.1 BMSCs的形态特征

3.2 BMSCs的特异性表面抗原特征

3.3 小鼠心肌细胞的典型形状和特征

3.4 目的基因质粒pEGFP-C1-mHCN2的鉴定

3.5 pEGFP-C1-mHCN2转染BMSCs后的表达情况

3.6 mHCN2蛋白在BMSCs中的表达情况

3.7 cTnI在四组BMSCs中的表达情况

3.8 mHCN2，Adrb1和Chrm2 mRNA在四组中的变化趋势

4. 讨论

4.1 HCN2通道特性与交感神经/副交感神经调节的关系

4.2 mHCN2基因转染对Adrb1和Chrm2转录的影响

4.3 与心肌细胞共培养对BMSCs中mHCN2,Adrb1和Chrm2表达的影响

4.4 本研究的不足与展望

5. 结论

参考文献

附录

致谢

综述:心律失常的生物学治疗进展