丹参酮ⅡA通过激活PXR对H2O2致内皮细胞损伤的保护作用

摘要

目的：孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)作为核受体(nuclear receptor, NR)超家族成员之一，广泛分布在肝脏、肠、肾脏中，参与体内众多药物代谢酶及转运体的调控,在机体内内源性和外源性物质和药物的吸收、分布、代谢及排泄等过程中扮演重要角色。前期实验室构建了基于分泌型Gaussia荧光素酶报告基因PXR-CYP3A4通路的稳定工程细胞株并成功用于PXR激活效应的快速筛选，发现丹参中主要有效脂溶性成分丹参酮IIA（Tanshinone IIA, Tan IIA）具有明显的PXR激活效应，同时Tan IIA亦被证实具有明显的心血管保护效应。近来文献报道PXR除了在肝脏表达外，在心血管系统中也有大量表达，那么Tan IIA的潜在药理效应及其心血管保护作用是否与其激活PXR有关。因此，本课题主要是基于PXR研究Tan IIA血管保护的效应机制。依据PXR效应的筛选结果，首先通过人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial, HUVECs)细胞为载体，进一步确证Tan IIA对PXR表达以及活性的影响，利用过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）致血管内皮细胞氧化损伤的模型，检测PXR在Tan IIA介导的心血管保护机制中发挥的作用，为全面理解Tan IIA的心血管保护的作用及其药理活性机制提供新的可能机制，为Tan IIA及其类似药物的研究开发及临床安全用药提供实验依据。
　　方法：（1）为了筛选到最佳药物浓度，分别将5~200μM Tan IIA作用于HUVECs细胞24 h：50~800μM H2O2作用HUVECs细胞3h，用CCK-8检测细胞活力。（2）5~200μM Tan IIA预处理HUVECs细胞24h，再给与400μM H2O2处理3 h后，并分别用qRT-PCR及Western-blot检测PXR的mRNA及蛋白表达。（3）细胞处理完提取总RNA，用qRT-PCR检测PXR调控的靶基因CYP3A4，以及MDR1，GST，GSTM1的表达。（4）通过siRNA技术敲低HUVECs细胞内PXR表达，流式细胞仪检测 PXR正常表达和敲低两种条件下H2O2致细胞损伤及Tan IIA逆转效应在两种条件下的差异。（5）ELISA试剂盒检测H2O2诱导对HUVECs细胞凋亡信号分子Caspase3/7、8、9的影响，荧光显微镜观察Hoechst33342染色，TUNEL凋亡试剂盒检测DNA的变化，高内涵细胞成像技术检测凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）的核内转移现象。
　　结果：（1）低浓度Tan IIA对内皮细胞活力没有明显的影响，高浓度时有明显的细胞毒性。根据细胞活力实验选出最佳药物浓度5~20μM预处理HUVECs细胞24 h后在给与400μM H2O2处理3h。（2）5、10、20μM Tan IIA单独处理细胞24 h，可以浓度依赖性的诱导 HUVECs细胞 PXR mRNA和蛋白的表达，同时上调CYP3A4、MDR1、GST、GSTM1和GPx的表达。（3）Tan IIA可以抑制H2O2诱导的HUVECs细胞ROS，MMP和凋亡的升高，在PXR敲低条件下，Tan IIA的保护作用明显减弱。（4）Tan IIA可以明显抑制H2O2诱导的HUVECs细胞凋亡及其相关凋亡分子的表达，减少其导致的HUVECs细胞凋亡。
　　总结：Tan IIA通过激活PXR受体并进一步上调其调控的靶基因CYP3A、GST、GSTM1和GPx的表达，实现对H2O2诱导的HUVECs细胞的氧化损伤的保护作用；同时Tan IIA可通过激活PXR受体抑制线粒体凋亡途径，降低H2O2诱导的HUVECs细胞凋亡，这可能是Tan IIA血管内皮细胞的保护作用新的机制之一。同时Tan IIA对PXR激活及对CYP3A4诱导存在发生药物相互作用的潜在风险，临床联合用药时应给予关注。

目录

声明

英文缩略词

第一部分丹参酮IIA对HUVECs中PXR的激活作用

1 前言

2 材料与方法

2.1 药品与试剂

2.2 仪器与设备

2.3 细胞培养

2.4 药物母液配制

2.5 CCK-8检测HUVECs细胞活力

2.6 qRT-PCR检测PXR和CYP3A4的mRNA表达

2.7 Western-blot 检测PXR的蛋白表达

2.8 siRNA转染PXR基因

2.9 统计分析

3 结果

3.1 丹参酮IIA和H2O2对HUVECs细胞活力的影响

3.2 丹参酮IIA对HUVECs细胞PXR mRNA和蛋白的影响

3.3丹参酮 IIA对HUVECs细胞CYP3A4 mRNA影响

4 讨论

第二部分 丹参酮IIA通过激活PXR保护H2O2诱导的细胞氧化损伤

1 前言

2 材料与方法

2.1 药品与试剂

2.2 仪器与设备

2.3 细胞培养

2.4 药物母液配制

2.5 CCK-8检测HUVECs细胞活力

2.6 HUVECs细胞形态学观察

2.7 流式细胞术检测HUVECs细胞ROS含量

2.8 ELISA检测HUVECs细胞GSH和GSSG含量

2.9 qRT-PCR检测HUVECs细胞PXR、MDR1、GST、GPx和GSTM1 mRNA表达

2.10 siRNA转染HUVECs细胞 PXR基因

2.11 统计分析

3结果

3.1 丹参酮IIA和H2O2对HUVECs细胞形态的影响

3. 2 PXR在丹参酮IIA 保护H2O2诱导的HUVECs细胞损伤的作用

3.3 PXR对丹参酮IIA诱导的代谢酶和抗氧化酶基因表达的影响

3.4 PXR对丹参酮IIA诱导的抗氧化酶蛋白表达的影响

4 讨论

第三部分 丹参酮IIA激活PXR保护H2O2诱导的细胞凋亡和炎症

1 前言

2 材料与方法

2.1 药品与试剂

2.2仪器与设备

2.3 细胞培养

2.4 药物母液配制

2.5 细胞凋亡检测

2.6 线粒体膜电位检测

2.7细胞Caspace3/7、8、 9检测

2.8 Hoechst 33342 凋亡形态学检测

2.9 Western-blot 检测凋亡信号分子

2.10高内涵检测凋亡诱导因子（AIF）的易位

2.11 DNA fragment检测

2.12丹参酮IIA对H2O2诱导HUVECS细胞粘附的影响

2.13 PXR对丹参酮IIA保护H2O2诱导HUVECS细胞IL-8的影响

2.14 统计分析

3结果

3.1 PXR对H2O2诱导的HUVECs细胞凋亡的影响

3.2 丹参酮IIA对H2O2损伤的细胞核和Caspase酶的影响

3.3 PXR对H2O2诱导的HUVECs细胞凋亡信号分子的影响

3.4 高内涵检测丹参酮IIA对凋亡诱导因子核内移位的影响

3.5 丹参酮IIA对H2O2诱导的HUVECs细胞DNA fragment的影响

3.6 Tan IIA对H2O2诱导HUVECS细胞粘附的影响

3.7 PXR对丹参酮IIA保护H2O2诱导HUVECS细胞炎症的影响

4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

综述:PXR/CYP的生物学特性及参与体内代谢的作用