姜黄素后处理通过激活SIRT1/FOXO1信号通路抵抗脑缺血再灌注损伤

摘要

研究背景：　　脑卒中（stroke）又称为脑血管意外，是导致神经功能急剧丧失和获得性残疾的最主要原因以及全球第二位致死原因，其中85％的脑卒中为缺血性脑卒中（ischemic stroke）。对于缺血性脑卒中而言，及早恢复缺血区血流是避免损伤进一步加重的最有效策略，可及时挽救缺血半暗带或血流灌注相对不足、功能受损但依然存活的脑组织，但在血流恢复的同时，脑组织内活性氧也随之大量产生，将进一步损伤脑组织，这种现象称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）。大量研究证实，减轻CIRI能明显减少脑梗体积、改善神经功能、减少凋亡和氧化应激损伤。姜黄素是从姜科植物根茎中提取的一种化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多重生物学活性，且副作用小、经济、安全，是抗CIRI领域极具研究价值和开发前景的药物。姜黄素抵抗CIRI已有报道，但是多数研究注重探讨姜黄素预处理对CIRI的保护作用，而姜黄素后处理的作用及其机制研究甚少。本课题拟采用在体与离体实验综合探讨姜黄素后处理对于CIRI的作用，并初步探讨其具体分子机制。　　目的：　　1)探究姜黄素后处理能否减轻脑缺血再灌注引起的脑梗、神经损伤以及能否减轻凋亡和氧化应激损伤；　　2)探究SIRT1/FOXO1信号通路是否介导姜黄素后处理抗CIRI作用。　　方法：　　1)用线栓闭塞大脑中动脉建立脑缺血再灌注损伤模型；　　2) HT22神经元细胞系缺氧复氧模拟体内缺血再灌注损伤；　　3)小鼠缺血再灌注后24小时检测神经功能学评分；　　4) TTC染色检测再灌注24小时后脑梗体积；　　5)检测各组小鼠缺血再灌注和细胞缺氧复氧后ROS产量、MDA含量以及SOD和GSH-Px活性；　　6)检测再灌注24小时后脑组织线粒体复合物I活性；　　7) TUNEL染色检测HT22细胞缺氧复氧后凋亡比例；　　8) Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3）以及SIRT1信号通路相关蛋白（SIRT1、Ac-FOXO1、Ac-p53）的表达变化情况；　　9)小干扰RNA阻断HT22细胞系SIRT1的表达。　　结果：　　1)脑缺血再灌注后，脑组织内SIRT1的表达量和活性与Sham组小鼠相比明显降低，姜黄素后处理可呈剂量依赖性地增加SIRT1的表达和活性。离体细胞学实验也同样证实，姜黄素后处理可以明显增加HT22细胞缺氧复氧后SIRT1的表达和活性。　　2)姜黄素后处理通过激活SIRT1信号通路减少小鼠缺血再灌注后脑梗体积、神经功能损害。Sham组小鼠未发生脑梗，且神经功能正常。与 Sham组小鼠相比，IR组小鼠发生明显脑梗，且神经功能严重受损。姜黄素后处理呈剂量依赖性地减少小鼠脑梗体积和神经功能损害，且姜黄素给药剂量为100 mg/kg时保护作用最佳。EX527特异性阻断 SIRT1信号通路后，姜黄素减少脑梗体积和神经功能损害的作用明显削弱。此外，离体实验结果表明，姜黄素后处理可以明显缓解缺氧复氧引起的细胞活力下降。而用SIRT1特异性siRNA干扰SIRT1的表达可明显削弱姜黄素的保护作用。　　3)姜黄素后处理通过激活SIRT1信号通路减轻小鼠脑缺血再灌注后氧化应激损伤。为了检测小鼠缺血再灌注后脑组织氧化应激情况，我们检测了各组小鼠脑组织ROS产量、MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。结果显示，与Sham组小鼠相比，IR组小鼠ROS产量和MDA含量明显增高，而SOD和GSH-Px的活性明显降低。姜黄素后处理可呈剂量依赖性地减少脑缺血再灌注后 ROS产量和 MDA含量，并增加SOD和GSH-Px活性，且姜黄素给药剂量为100 mg/kg时保护作用最佳。EX527特异性阻断 SIRT1信号通路后，姜黄素减轻氧化应激损伤的作用明显削弱。离体实验结果显示，姜黄素后处理可以明显减少HT22细胞缺氧复氧后ROS产量和MDA含量，并增加细胞SOD和GSH-Px活性。而用SIRT1特异性siRNA干扰SIRT1的表达可明显削弱姜黄素的保护作用。　　4)姜黄素后处理通过激活 SIRT1信号通路减轻小鼠脑缺血再灌注引起的凋亡。与Sham组小鼠相比，IR组小鼠Bax和Caspase-3表达量明显增高，而Bcl-2的表达量明显降低。姜黄素后处理可呈剂量依赖性地减少脑缺血再灌注后 Bax和Caspase-3表达量，并增加Bcl-2的表达量，且姜黄素给药剂量为100 mg/kg时保护作用最佳。EX527特异性阻断 SIRT1信号通路后，姜黄素减轻凋亡的作用明显削弱。离体实验结果显示，姜黄素后处理可以明显减少HT22细胞缺氧复氧后Bax和Caspase-3表达量以及凋亡率，并增加细胞 Bcl-2的表达量。而用 SIRT1特异性siRNA干扰SIRT1的表达可明显削弱姜黄素的保护作用。　　研究结论：　　1)姜黄素后处理是缓解脑缺血再灌注损伤的有效策略之一。可显著改善脑梗体积、神经功能、凋亡以及氧化应激损伤等；　　2) SIRT1/FOXO1信号通路可通过减轻氧化应激损伤和凋亡介导姜黄素后处理抗脑缺血再灌注损伤作用。

目录

声明

缩略语表

文献回顾

一、脑缺血再灌注损伤的发病机制

二、脑缺血再灌注损伤的保护策略

三、姜黄素的脑保护作用及其机制

第一部分 姜黄素后处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 SIRT1信号通路介导姜黄素后处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 姜黄素通过激活SIRT1信号通路缓解海马神经元细胞缺氧复氧损伤

1 材料

2 方法

3 结果

4小结

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢