基于SIRT1信号通路探讨中药复方发酵液“栓通灵”对大鼠脑缺血再灌注损伤的防治作用及机制

摘要

目的：本课题组在分析总结前人防治缺血性脑卒中用药的基础上，再加以临床诊疗过程中的经验及理解，组成了具有特色的新方发酵液—“栓通灵”（STL）。本课题拟采用线栓法建立右侧大鼠脑缺血再灌注（I/R）模型，并试图从抗炎和抗凋亡角度探讨SIRT1信号通路在中药复方发酵液“栓通灵”防治脑缺血再灌注损伤的可能作用机制。
　　方法：
　　(1)中药复方发酵液“栓通灵”制备：葛根、丹参、姜黄、白芥子、山楂、石见穿、白术、柴胡、菊花、天麻、白芍、竹节参、黄芪、香附14味中药材按比例称取，切片，将药材总重量与水按1:10的水量浸泡药材30 min后，100℃煎煮60 min，煎煮液由10倍水量浓缩至5倍水量即可用于发酵。发酵微生物为：酵母菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌以1:1:1的配比后加入煎煮液中，于37℃发酵2天，过滤得到发酵药液，最后经巴氏消毒灌装。
　　(2)高效液相色谱法检测“栓通灵”中所含的主要药物成分：在同一色谱条件和进样量下，分别测定“栓通灵”中葛根素、芍药苷、丹酚酸B、竹节参皂苷V、黄芪甲苷IV、姜黄素以及已知的葛根素、芍药苷、丹酚酸B、竹节参皂苷V、黄芪甲苷IV、姜黄素标准品的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的标准品进行比较，两者基本相同，从而确定混合样品中是否含有以上6种物质。
　　(3)将40只体重为250-280 g的 specific pathogen free（SPF）级Sprague-Daewley（SD）大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、“栓通灵”低剂量组、“栓通灵”高剂量组和“栓通灵”+EX527组。“栓通灵”低剂量组的大鼠按5.7 mL/kg剂量灌胃法给予“栓通灵”，“栓通灵”高剂量组与“栓通灵”+EX527组的大鼠按17.2 mL/kg剂量灌胃法给予“栓通灵”，“栓通灵”+EX527组的大鼠每两天腹腔注射5 mg/kg剂量的EX527（SIRT1抑制剂），假手术组和模型组的大鼠灌胃法给予等量的生理盐水。预给药7d后，应用线栓法建造大鼠右侧大脑中动脉闭塞90 min，再灌注24 h的模型。
　　(4)各组于再灌注24 h的时间点观察大鼠的行为动作，同时进行神经功能损伤评分。
　　(5) TTC染色法检测缺血再灌注24 h后大鼠脑梗死面积。
　　(6) ELISA法检测缺血再灌注24 h后大鼠缺血半侧脑组织中IL-1β和TNF-α的含量。
　　(7) Western Blotting法检测缺血再灌注24 h后大鼠缺血半侧脑组织SIRT1、Ac-p53、Bcl-2及Bax蛋白的表达。
　　结果：
　　(1)中药复方发酵液“栓通灵”中含有葛根素、芍药苷、丹酚酸B、竹节参皂苷V、黄芪甲苷IV、姜黄素6种主要成分。
　　(2)模型组大鼠的神经功能损伤评分较假手术组明显升高，“栓通灵”低剂量组和“栓通灵”高剂量组大鼠的神经功能损伤评分较模型组显著降低，“栓通灵”+EX527组大鼠神经功能损伤评分显著高于“栓通灵”高剂量组。
　　(3)模型组大鼠的脑梗死面积较假手术组明显增大，“栓通灵”低剂量组和“栓通灵”高剂量组大鼠的脑梗死面积较模型组显著降低，“栓通灵”+EX527组大鼠脑梗死面积显著高于“栓通灵”高剂量组。
　　(4)模型组大鼠缺血侧脑组织中的TNF-α和IL-1β的含量较假手术组明显升高，“栓通灵”低剂量组和“栓通灵”高剂量组大鼠的缺血侧脑组织中的炎症因子TNF-α和IL-1β的含量较模型组显著降低，“栓通灵”+EX527组大鼠缺血侧脑组织中的炎症因子TNF-α和IL-1β的含量显著高于“栓通灵”高剂量组。
　　(5)模型组大鼠缺血侧脑组织中的SIRT1、Bcl-2蛋白的表达量较假手术组明显降低，“栓通灵”低剂量组和“栓通灵”高剂量组大鼠的缺血侧脑组织中的SIRT1、Bcl-2蛋白的表达量较模型组显著增高，“栓通灵”+EX527组大鼠缺血侧脑组织中SIRT1、Bcl-2蛋白的表达量显著低于“栓通灵”高剂量组；模型组大鼠缺血侧脑组织中的Ac-p53、Bax蛋白的表达量较假手术组明显增高，“栓通灵”低剂量组和“栓通灵”高剂量组大鼠的缺血侧脑组织中的Ac-p53、Bax蛋白的表达量较模型组显著降低，“栓通灵”+EX527组大鼠缺血侧脑组织中Ac-p53、Bax蛋白的表达量显著高于“栓通灵”高剂量组。
　　结论：
　　(1)中药复方发酵液“栓通灵”可减轻脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能损伤，减少脑梗死面积，进而发挥对脑组织的保护作用；
　　(2)中药复方发酵液“栓通灵”可降低脑缺血再灌注模型大鼠缺血脑组织中TNF-α和IL-1β的含量，减轻大鼠脑缺血再灌注炎症损伤；
　　(3)中药复方发酵液“栓通灵”可上调脑缺血再灌注模型大鼠缺血脑组织中SIRT1和Bcl-2蛋白表达，下调Ac-p53和Bax蛋白表达；
　　(4)激活SIRT1信号通路，使其发挥去乙酰化作用，进而抗炎抗凋亡，可能是“栓通灵”干预大鼠脑缺血再灌注损伤的机制，这为我们研发一种可防治脑血管病，且便于长期服用的保健药品提供了思路和理论参考。

目录

声明

英文缩略词表

引言

1.1 材料

1.1.1中药材

1.1.2实验动物

1.1.3药品与试剂

1.1.4主要试剂配制

1.1.5实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1动物分组与给药

1.2.2大鼠右侧局部脑缺血再灌注模型的建立

1.2.3指标检测

1.2.4统计学处理

结果

2.1 中药复方发酵液STL中含有的成分定性分析

2.2 STL通过SIRT1通路对大鼠神经功能损伤评分的影响

2.3 STL通过SIRT1通路对大鼠脑梗死面积的影响

2.4 STL通过SIRT1通路对大鼠缺血脑组织TNF-α和IL-1β含量变化的影响

2.5 STL通过SIRT1通路对大鼠缺血脑组织SIRT1、Ac-p53、Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响

讨论

小结

参考文献

综述:沉默信息调节因子1信号通路在脑缺血-再灌注损伤中的保护作用

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著