人脑胶质母细胞瘤转录组DNA甲基化改变的临床研究

摘要

背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma）、也称多形性胶质母细胞瘤Glioblastoma multiforme，GBM），是一类分子异质性极强、且临床结局较差的肿瘤性疾病。在所有肿瘤相关的分子调控机制中，DNA甲基化在决定肿瘤生物学特征方面发挥非常重要的作用，其中包括（但不局限于）调控基因表达水平和维持染色体结构的稳定。既往研究表明，GBM通常伴随着显著的表观遗传学改变，其中以全局性非基因区域DNA重复序列的低甲基化改变和局部基因区域镶嵌有CpG岛（CpG island，CGI）超甲基化改变的低甲基化区段最具特征性。遗憾的是，目前我们对于GBM相关的DNA低甲基化在肿瘤发生发展过程中的作用和意义还了解甚少。研究表明：肿瘤基因组DNA甲基化整体水平的下降主要来自于非基因区域DNA重复序列的甲基化丢失。另一方面，肿瘤相关的DNA超甲基化改变则主要发生在基因启动子相关区域的CpG岛结构内。然而，人类基因组中有将近一半的基因，其转录调控区域并不含有CpG岛结构，该区域内DNA甲基化在肿瘤中的改变模式目前尚未有明确结论。本研究旨在利用高通量DNA甲基化检测技术从组学的水平上探讨GBM转录组、特别是非CpG岛Open sea区域DNA甲基化的改变模式和意义。　　方法：本研究共纳入129例新发GBM成年患者（≥18岁）的肿瘤组织样本和6例接受手术治疗的慢性癫痫患者的非肿瘤脑组织对照样本。所有组织样本均来自于法国雷恩第一大学附属雷恩与安格尔医院神经外科中枢神经系统肿瘤生物样本库，病例收集于2004年1月至2013年12月。所有组织样本的收集及入库均符合法国生物样本收集标准及赫尔辛基宣言要求，并取得相应患者的知情同意书。所有纳入的GBM病例均接受替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）标准同步放、化疗。组织样本的全基因组DNA甲基化和基因表达水平的检测工作分别由美国Illumina公司的Infinium HumanMethylation27k/450k芯片平台和Agilent公司的Whole Genome4×44K芯片平台完成。另外，本研究亦纳入来自肿瘤基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达公共数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）等公共数据库中不同病例系列的各级别胶质瘤样本。Illumina甲基化芯片中所有基因（蛋白编码或非蛋白编码）相关的探针纳入后续分析。差异甲基化位点和差异表达基因分别由wilcoxon和标准t检验进行计算。我们定义GBM特征性改变的甲基化位点符合肿瘤与非肿瘤组织的中位β差值≥0.2且错误发现率（False Discovery Rate，FDR）≤0.05的标准。Pearson关联分析用于评估基因甲基化与表达谱数据间的关联程度。我们定义甲基化依赖的基因表达关系的标准为Pearson系数的绝对值≥0.3且P≤0.05。研究采用从训练到验证的建模思路，建立风险评分模型。生物信息学分析主要包括基因簇富集分析（Gene Set Enrichment analysis，GSEA）和基因功能注释聚类分析（DAVID）。主成分分析（Principal components analysis，PCA）用于比较不同病理级别或不同组织类型间胶质瘤样本的DNA甲基化模式。不同组间频数的差异由卡方或Fisher精确检验进行比较。Log-rank检验用于比较不同组间总体生存期（Overall survival，OS）的差异，Kaplan-Meier法用于计算患者生存率，所有检验均采用双侧检验，P≤0.05为具有统计学意义。统计分析软件均采用R软件。　　结果：我们一共筛选出801个CpG位点作为GBM特征性甲基化位点的代表，这些位点在纳入分析的4组病例组中的至少3组中符合肿瘤特征性甲基化位点的定义。其中399个CpG位点在GBM中发生超甲基化改变，402个位点发生低甲基化改变。PCA分析结果支持上述CpG位点的可靠性。通过分析这些CpG位点在GBM中甲基化水平的改变模式与其CpG岛距离定位关系之间的分布特征，我们发现，绝大多数（97％）CpG岛内的CpG位点在肿瘤中发生超甲基化改变，而这一比例随着位点与相邻CpG岛之间的距离的增加而下降，只有75%的Shore区域内的CpG位点和37%的Shelf区域内的CpG位点在肿瘤中发生超甲基化改变。然而对于距离CpG岛最远的Open Sea区域内的CpG位点，只有7%发生超甲基化改变。换句话说，非CpG岛Open Sea区域内的CpG位点绝大多数（93%）在GBM中发生低甲基化改变。基因表达数据关联分析表明：非CpG岛Open sea区域相关的基因，相对于那些CpG岛及CpG岛邻近区域相关的基因，其发生肿瘤相关的差异表达和DNA甲基化依赖的基因表达的概率显著降低。患者总体生存期关联分析发现：在所有预后相关的CpG点中，几乎所有（96-100%）来自CpG岛区域的位点的DNA甲基化均与患者生存数据呈负相关关系。相反，几乎所有（96-100%）来自非CpG岛Open Sea区域的位点的DNA甲基化与患者生存时间呈正相关关系。DAVID数据库分析发现：对应于CpG岛区域位点的众多基因中，主要富集与发育和转录过程相关的基因，而对应于非CpG岛Open Sea区域位点的基因中，主要富集与免疫反应相关的基因。接下来我们建立了一组基于8个免疫基因相关的非CpG岛Open Sea区域CpG位点甲基化状态的风险评分方程。具体方程如下：风险分值=(-1.07×cg02833180探针的β值)+(-3.06×cg09238677探针的β值)+(-1.89×cg18343292探针的β值)+(-1.54×cg18854666探针的β值)+(-1.65×cg18881723探针的β值)+(-3.44×cg25511807探针的β值)+(-1.93×cg26066361探针的β值)+(-1.65×cg22502502探针的β值)。我们计算出最佳分组界值为-5.17（约为所有训练组样本风险分值的第40%分位数）。生存分析表明，甲基化风险评分方程在不同的病例组中均能够稳定、准确地预测患者的生存期。Cox风险回归分析表明，甲基化风险评分方程是独立的预后指示因子。GSEA分析提示：甲基化风险评分方程的分组与不同的表达谱免疫表型密切相关：高风险组样本富集免疫功能相关的基因簇，说明这些肿瘤具有免疫异常激活的表型。我们还发现：在GBM中发生特征性改变的甲基化位点在较低级别胶质瘤（Lower grade glioma，LGG）中也同样发生改变，只是程度不同。与非肿瘤脑组织相比，各级别胶质瘤中CpG岛区域位点的整体DNA甲基化程度明显增高，而在不同病理级别的胶质瘤之间，CpG岛区域位点的整体DNA甲基化程度变化趋于平缓；相反，非CpG岛Open Sea区域位点的整体DNA甲基化水平在LGG与非肿瘤脑组织之间的差异程度并不明显，但随着病理级别的升高，该区域内的DNA甲基化程度显著降低，尤以GBM为甚。最后，甲基化风险评分方程在LGG中也与患者预后和表达谱免疫表型密切相关。　　结论：本研究从组学水平上探讨基因非CpG岛Open sea区域DNA低甲基化在GBM中的临床和生物学意义。我们发现：与基因CpG岛超甲基化相似，非CpG岛Open sea区域DNA低甲基化改变也是GBM中特征性发生的表观遗传学分子改变，提示其在GBM分子诊断中具有潜在价值。与CpG岛和CpG岛相邻区域比较，非CpG岛Open sea区域内的DNA甲基化改变对基因表达水平的影响相对有限。更重要的是，我们发现了基因非CpG岛Open sea区域DNA甲基化与患者生存期之间广泛存在的正相关关系，提示其在GBM预后评估中的重要意义。我们所建立的基于8个免疫基因相关的Open sea区域低甲基化的风险评分方程就是一个具有潜在实用价值的GBM预后评估工具。该甲基化评分方程与免疫表型之间的密切关系提示其在肿瘤表观遗传学和免疫治疗中可能具有指导价值。不同表观遗传学区域的DNA甲基化在胶质瘤发生、发展中可能发挥了不同的作用，CpG岛的DNA超甲基化改变很可能主要与胶质瘤发病过程相关，而非CpG岛Open sea区域的DNA低甲基化改变则有可能主要在胶质瘤进展恶化过程中发挥作用。综上所述，本研究首次从组学水平上着重强调了基因非CpG岛Open sea区域DNA低甲基化改变在胶质瘤发生、发展中的重要作用，未来还需要更多的研究来关注该区域内DNA甲基化改变在肿瘤生物学中的重要意义。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1.国内脑胶质瘤治疗与管理现状

2. 表观遗传学机制及生理意义

3. 肿瘤组织的表观遗传学改变

4. 表观遗传学肿瘤分子标记物

5. 肿瘤表观遗传学治疗策略

6. DNA低甲基化与肿瘤

7. 表观遗传学与肿瘤免疫

8. 高通量DNA甲基化检测技术

第一部分 胶质母细胞瘤转录组DNA甲基化改变模式及其临床和生物学意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 基于8个免疫基因相关的非CpG岛Open Sea区域位点甲基化状态的GBM预后评价模型

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢