miR--10b与靶基因KLF4相互作用调节精原干细胞的自我更新

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第一章研究背景

1.1引言

1.2.精原干细胞的特性

1.2.1精原干细胞和精子发生

1.2.2.精原干细胞的壁龛

1.2.3.精原干细胞的体外培养和移植

1.2.4.精原干细胞表达的相关基因

1.2.5.精原干细胞自我更新的信号通路

1.3. MicroRNA

1.3.1. microRNAs的合成

1.3.2. MicroRNAs的调控作用

1.4课题的研究目的和意义

第二章实验材料与方法

2.1.1实验技术方案

2.1.2实验动物

2.1.3.CD-1小鼠精原干细胞体外长期培养体系

2.2.实验使用引物序列

2.3.试剂配置

2.3.1. STO培养液的配置

2.3.2. PBS的配置

2.3.3. D-Hanks的配置

2.4.1.饲养层细胞（ STO）准备

2.4.2. 精原干细胞的分离

2.4.3.精原干细胞的纯化

2.4.4. 精原干细胞的培养

2.4.5. 精原干细胞的传代

2.4.6. 细胞冻存

2.4.7. 细胞复苏

2.4.8. 细胞换液

2.5.载体构建

2.5.1 mmu-miR-10b过表达慢病毒载体的构建

2.5.2. Mmu-miR-10b干扰慢病毒载体的构建

2.5.3 KLF4 shRNA慢病毒构建流程

2.6.慢病毒的包装

2.7.慢病毒生产过程

2.7.1.穿梭质粒和包装质粒经过在细菌中扩增后需要大量的去内毒素抽提，使得质粒的浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8间方可包毒

2.7.2.准备293T细胞

2.7.3.做脂质体转染Complex

2.7.4.病毒液的收集

2.7.5.细胞准备

2.7.6.病毒液稀释加入

2.8.细胞免疫荧光

2.9. EDU细胞增殖检测

2.9.1. 实验前准备

2.9.2. 细胞培养

2.9.3. EDU标记

2.9.4. 细胞固定

2.9.5. Apollo染色

2.9.6.DNA染色

2.10.CCK-8细胞增殖检测

2.11.细胞凋亡检测实验

2.12.小鼠睾丸组织和细胞总RNA的抽提检测实验：

2.12.1. 反转录合成cDNA

2.12.2. 实时荧光定量PCR

2.13.蛋白印迹检测相关蛋白的变化

第三章实验结果

3.1. MiR-10b在体外长期培养的CD-1小鼠SSCs中高表达

3.2.体外培养CD-1小鼠SSCs的鉴定

3.3.miR-10b对SSCs细胞增殖的调节

3.4.MiR-10b对SSCs细胞凋亡的调节

3.5.KLF4是miR-10b的靶基因

3.6. KLF4 基因敲降对精原干细胞增殖的影响

第四章讨论

第五章总结

第六章结论

参考文献

第七章综述:MicroRNAs对基因表达的调控机制

参考文献

致谢

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