一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用

摘要

本发明公开了一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用。所述的载体是包含奶山羊gSirt1基因的真核表达载体，所述的奶山羊gSirt1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明所构建的真核表达载体实现了在奶山羊精原干细胞中的过表达或超表达，经过RT-PCR、Western blot及细胞周期检测证实，gSirt1基因有助于精原干细胞的自我更新、干性(多能性)维持和细胞增殖。

说明书

技术领域

本发明属于精原干细胞技术领域，涉及一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)，又称作雄性生殖干细胞(male germline stem cell，mGSCs)，是位于睾丸曲细精管基膜上的一类成体干细胞，SSCs通过自我更新能够维持自身群体数量的稳定，又能发育分化形成精子细胞。研究显示，SSC在睾丸微环境中其可以像胚胎干细胞一样，在体内外具有分化产生三胚层在内的所有细胞类型的潜能(Oatley JM,BrinsterRL.Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.Annu RevCell Dev Biol 2008；24:263-86.)。精原干细胞可以作为研究精子细胞发生、减数分裂调控和细胞重编程的一个理想体外模型。

现已经初步建立了小鼠、人等胚胎生殖细胞和雄性生殖干细胞的培养体系，并了解了其基本的生物学特性(Kubota H,Avarbock MR,Brinster RL.2004.Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonialstem cells.Proc Natl Acad Sci U S A.101(47):16489-16494；Oatley JM,Avarbock MR,Telaranta AI,Fearon DT,Brinster RL.2006.Identifying genesimportant for spermatogonial stem cell self-renewal and survival.Proc Natl AcadSci U S A.103(25):9524-9529)，并分别从成年小鼠和人类睾丸组织分离得到多能性的雄性生殖干细胞(Chikhovskaya JV,Jonker MJ,Meissner A,Breit TM,Repping S,van Pelt AM.2012.Human testis-derived embryonic stem cell-likecells are not pluripotent,but possess potential of mesenchymal progenitors.Human Reproduction.27(1):210-221；Kossack N,Meneses J,Shefi S,NguyenHN,Chavez S,Nicholas C,Gromoll J,Turek PJ,Reijo-Pera RA.2009.Isolationand characterization of pluripotent human spermatogonial stem cell-derived cells.Stem Cells.27(1):138-149.)。后期研究发现CD49f、CD90(Thy1)、C-kit(CD117)、GFR1等可作为雄性生殖干细胞的特异性标记，并已用于纯化小鼠和人的雄性生殖干细胞(He Z,Jiang J,Hofmann MC,Dym M.2007.Gfra1silencing in mouse spermatogonial stem cells results in their differentiation via theinactivation of RET tyrosine kinase.Biology Of Reproduction.77(4):723-733；He Z,Kokkinaki M,Jiang J,Dobrinski I,Dym M.2010.Isolation,characterization,and culture of human spermatogonia.Biology Of Reproduction.82(2):363-372；Niu Z,Goodyear SM,Rao S,Wu X,Tobias JW,Avarbock MR,Brinster RL.2011.MicroRNA-21regulates the self-renewal of mousespermatogonial stem cells.Proceedings of the National Academy of Sciences.108(31):12740-12745.)。体外培养为研究mGSCs功能调控的分子机制及细胞信号通路提供了新的方法。尽管体外培养和扩增多能性ES细胞已经日趋常规化，但成体组织干细胞(包括mGSCs)体外培养技术的建立却依然较困难。尽管在过去的10年间，已报道了许多关于小鼠和大鼠mGSCs体外培养的进展(Kanatsu-Shinohara M,Lee J,et al..2008.Pluripotency of a singlespermatogonial stem cell in mice.Biology Of Reproduction.78(4):681-687；Oatley JM,Avarbock MR,Telaranta AI,Fearon DT,Brinster RL.2006.Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal andsurvival.Proc Natl Acad Sci U S A.103(25):9524-9529)。目前，啮齿类动物的mGSCs可以在体外培养很长的时间，细胞的增殖也很显著。有报道认为mGSCs具有转化为多能性干细胞的潜能(Kanatsu-Shinohara M,Lee J,et al..2008.Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice.Biology OfReproduction.78(4):681-687)。这一特性使得mGSCs具有巨大的优势，然而其具体的遗传、表观遗传及其发育潜能等机制还需要进一步研究。

组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)家族在成人干细胞分化中发挥重要作用，干细胞的分化过程中HDAC表达下调(McCool KW,Xu X,Singer DB,Murdoch FE,Fritsch MK.The role of histone acetylation inregulating early gene expression patterns during early embryonic stem celldifferentiation.J Biol Chem 2007；282:6696-706.)。哺乳动物组蛋白脱乙酰化酶家族现分为4个组，其中第三组就是Sirt1-7的去乙酰化酶sirtuins家族(Chalkiadaki A,Guarente L.Sirtuins mediate mammalian metabolic responses tonutrient availability.Nat Rev Endocrinol 2012；8:287-96.)。

Sirtuin是一种进化上高度保守的去乙酰化酶类，其家族成员有7个:Sirt1～Sirt7，都具有高度保守的NAD+结合域和催化功能域，不同的N端和C端可使它们能够结合不同的底物。

前期Coussens等人通过基因敲除技术获得了Sirt1双敲(Sirt1-/-)的小鼠模型，发现Sirt1缺陷小鼠寿命会缩短、体形变小、雄性小鼠会生成更多的不正常精子。Sirt1基因敲除后，小鼠睾丸内Oct4阳性的精原干细胞数目显著下降，精子发生过程受到阻滞，成熟精子明显减少。进一步研究发现，Sirt1基因敲除小鼠的成熟精子中发生了更多的DNA损伤。对Sirt1基因敲除小鼠的基因表达谱分析后发现，85个涉及精子发生和蛋白sumo化的基因表达发生了变化(Coussens M,Maresh JG,Yanagimachi R,Maeda G,Allsopp R.Sirt1deficiency attenuates spermatogenesis and germ cell function.PLoS One 2008；3:e1571.)。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用，通过构建gSirt1真核表达载体并转染到奶山羊精原干细胞，促进奶山羊精原干细胞的自我更新能力及细胞增殖能力。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体，是包含奶山羊gSirt1基因的真核表达载体。

所述的奶山羊gSirt1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述包含奶山羊gSirt1基因的真核表达载体转染奶山羊精原干细胞后，使其gSirt1基因过表达或超表达。

所述的真核表达载体上还设有抗生素筛选基因和标记基因。

所述的真核表达载体为pSirt1-IRES2-AcGFP，将奶山羊gSirt1基因克隆到pIRES2-AcGFP表达载体中，其中gSirt1和AcGFP通过IRES2相连接，构成双顺反子。

所述的促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体在促进奶山羊精原干细胞的自我更新、维持多能性和增殖中的应用。

所述的真核表达载体转染奶山羊精原干细胞后gSirt1基因过表达或超表达，并上调与自我更新和多能性相关基因的表达，上调细胞增殖相关基因和细胞周期蛋白的表达。

所述的自我更新和多能性相关基因包括Oct4和Plzf，所述的细胞增殖相关基因包括Myc和PCNA，细胞周期蛋白为CCNA1。

所述的真核表达载体转染奶山羊精原干细胞后促使其进入细胞周期的S期，加快细胞增殖。

一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的方法，包括以下操作：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的奶山羊gSirt1基因，并将其克隆到真核表达载体中构建gSirt1真核表达载体；

2)在DMEM-F12培养液中，以奶山羊精原干细胞为待转染的细胞，加入混匀在Opti-MEM中的gSirt1真核表达载体，再加入转染试剂TurboFect进行转染，室温孵育；

3)gSirt1过表达或超表达的奶山羊精原干细胞，其自我更新能力增高，细胞增殖加快。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体，是以与精子发生相关的Sirt1基因作为目的基因构建真核表达载体，以奶山羊精原干细胞为宿主进行转导，促使精原干细胞中gSirt1基因过表达或超表达。本发明所构建的真核表达载体实现了在奶山羊精原干细胞中的过表达或超表达，经过RT-PCR、Western blot及细胞周期检测证实，gSirt1基因有助于精原干细胞的自我更新、干性(多能性)维持和细胞增殖。

本发明提供的促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体，在转染奶山羊精原干细胞后，gSirt1基因过表达(与对照相比相对表达量达125倍)。

由于gSirt1基因过表达，其上调了自我更新和多能性相关基因Plzf，其相对表达量上调了56倍；还上调了细胞增殖相关基因Myc、PCNA和细胞周期蛋白CCNA1，其中Myc相对表达量上调了2.5倍，PCNA相对表达量上调了5倍，CCNA1相对表达量上调了4.5倍，与对照相比表达显著上调。而这些与自我更新、多能性和细胞增殖的基因上调，揭示gSirt1基因在奶山羊精原干细胞过表达后能够促进奶山羊精原干细胞的自我更新、维持多能性和增殖。而细胞周期的流式细胞术检测进一步发现，在奶山羊精原干细胞中超表达Sirt1后，处于G1/G0期的细胞显著性减少，而处于S期的细胞显著性增多。

本发明提供的促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体，能够促使奶山羊精原干细胞的自我更新能力增高，细胞增殖加快，Sirt1在精原干细胞中也能发挥调节和维持自我更新和多能性的作用，能在构建永生化奶山羊精原干细胞的研究中发挥潜在的积极作用。

附图说明

图1是pSirt1-IRES2-AcGFP表达载体的质粒图谱；

图2是EcoRI和BamHI双酶切的阳性重组质粒pSirt1-IRES2-AcGFP、gSirt1基因片段和pIRES2-AcGFP载体；

图3是荧光显微镜观察pSirt1-IRES2-AcGFP载体阳性表达的奶山羊精原干细胞的报告基因EGFP表达和Sirt1抗体染色的结果图；

图4-1～图4-3是Sirt1在奶山羊精原干细胞中超表达后定量PCR和Western Blot检测；

图5是Sirt1在奶山羊精原干细胞中超表达后48h的细胞周期检测。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体，是以与精子发生相关的Sirt1基因作为目的基因构建真核表达载体，以奶山羊精原干细胞为宿主进行转导，促使精原干细胞中gSirt1基因过表达或超表达。

具体的，本发明首先构建含有gSirt1和绿色荧光蛋白(AcGFP)基因的真核表达载体pSirt1-IRES2-AcGFP，将该载体转染导入奶山羊雄性生殖干细胞，荧光显微镜观察标记基因AcGFP和Sirt1抗体染色检测其表达情况，证实目的基因gSirt1在奶山羊雄性生殖干细胞中表达良好。

所涉及的主要试剂如下：DMEM-F12培养基均购自美国GIBCO(Invitrogen)公司，EDTA购自美国Sigma公司，胎牛血清为美国HYCLONE(HYCLONE)公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒购自天根公司，反转录试剂盒和TurboFect转染试剂均购自Thermo公司，Sirt1抗体购自Bioworld公司。DNA聚合酶购自TAKARA公司。

下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明。

1、真核表达载体pSirt1-IRES2-AcGFP的构建

a、目的基因奶山羊gSirt1的克隆

根据GeneID:XM_005699096.1所公布的gSirt1mRNA序列设计引物P1和P2，以奶山羊精原细胞的cDNA为模板用引物P1、P2进行PCR扩增，引物序列如下：

前向引物P1:CGAGAATTCGTTGAAAGATGGCGG 24

后向引物P2:GCGCGGATCCCATTCAATTTGACAT 25

50μL的PCR反应体系为：5×Fly Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：2μL，P1(5μmol/L)：1μL，P2(5μmol/L)：1μL，FastPfu聚合酶(5U/μL)：0.15μL，模板：1.5μL，Mg²⁺(50mmol/L)：1μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，30个PCR循环，72℃再延伸7min；

将PCR产物与pMD-18T Vector酶切(EcoRI和BamHI双酶切)后4℃连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，通过氨苄抗性筛选、挑选重组子，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定阳性重组质粒pMD-18T-gSirt1并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。gSirt1基因测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，与公布的gSirt1mRNA序列(GeneID:XM_005699096.1)同源性为99.7％，因此，所克隆的基因为奶山羊的gSirt1基因。

b、pSirt1-IRES2-AcGFP的载体结构

本发明具体以pIRES2-AcGFP载体和pMD-18T-gSirt1载体构建包含目的基因gSirt1的真核表达载体pSirt1-IRES2-AcGFP(其质粒图谱如图1所示)。

pSirt1-IRES2-AcGFP载体的构建如下：

用EcoRI和BamHI分别双酶切，从pMD-18T-gSirt1载体上克隆的gSirt1和pIRES2-AcGFP(商购得到)，胶回收片段，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，并转化感受态细胞E.coli DH5α，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定阳性重组质粒。检测结果如图2所示，其中，泳道1为EcoRI和BamHI双酶切鉴定阳性重组质粒，可以见到5360bp和2121bp的两条条带，说明gSirt1通过EcoRI和BamHI酶切位点克隆到了载体pIRES2-AcGFP上；泳道2为EcoRI和BamHI双酶切的gSirt1片段，2121bp；泳道3为EcoRI和BamHI双酶切的pIRES2-AcGFP载体，可以看到一条约为5360bp的条带；泳道M为Marker，大小分别代表500bp、750bp、2500bp、1000bp、2000bp、3000bp、500bp和15000bp；将获得的重组质粒命名为pSirt1-IRES2-AcGFP。

pSirt1-IRES2-AcGFP载体包含新霉素抗性筛选基因neo^r和标记基因AcGFP；标记基因AcGFP可在哺乳动物细胞中高表达并产生荧光；本发明通过多克隆位点EcoRI和BamHI将目的基因gSirt1插入到pIRES2-AcGFP上的多克隆位点，使gSirt1基因在转染的细胞中表达。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本研究使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用天根公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为389ng/μl，OD260/280为1.89，说明质粒较纯，可用于转染。

2、pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体转染奶山羊雄性生殖干细胞

c、奶山羊雄性生殖干细胞的培养

从液氮中取一管奶山羊雄性生殖干细胞于37℃解冻，加0.8ml的DMEM-F12细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取4ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO₂培养箱中37℃条件下培养。

待奶山羊雄性生殖干细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于12孔板，放入CO₂培养箱中培养。奶山羊雄性生殖干细胞，培养至细胞达到80％汇合用于转染。

d、pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体转染奶山羊雄性生殖干细胞

本发明具体采用转染试剂TurboFect进行转染，将pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体导入奶山羊雄性生殖干细胞，具体为：

转染前一天，将奶山羊雄性生殖干细胞以1×10⁵接种于12孔板中，培养过夜使细胞达到70-80％汇合。对于每孔细胞，转染前换预热的新鲜DMEM-F12培养液，再将1μg pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体加入100μlOpti-MEM中进行混匀，然后加入2μl的TurboFect吹打混匀，室温孵育20min后，缓慢将其加入到细胞培养液中；6h后换新鲜的DMEM-F12培养液；48h后荧光显微镜观察。

转染试剂TurboFect是一种独特的阳离子多聚物水溶液，其与强效缓冲液配合使用可高效地将蛋白、抗体和多肽导入细胞质中。无论培养基中是否含有血清，该试剂均能转染蛋白。用TurboFect进行基因转移与其它方法相比，操作简便、重复性好、不受DNA大小限制、毒性小、转导效率高。

3、pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体阳性表达细胞的鉴定

48h后转染了pSirt1-IRES2-AcGFP真核表达载体的阳性奶山羊雄性生殖干细胞，进行细胞免疫荧光染色：1).将细胞用4％PFA室温固定15min，PBS洗2次，每次5min；2).用0.1％Triton-X 100室温破膜10min，PBS洗2次，每次5min；3).1％BSA室温孵育45min；4)吸去BSA，滴加适量按比例稀释的一抗，4℃孵育过夜；5).吸去一抗，PBS洗3次，每次5min；6).滴加适量按比例稀释的二抗，室温孵育1h，PBS洗3次，每次5min；7).加入含Hoechst 33342的细胞染核液，室温孵育3min，PBS洗3次，每次5min；8).滴加适量PBS，荧光显微镜观察并照相。

检测结果如图3所示，其中，AcGFP为绿色荧光下观察到的AcGFP表达结果，SIRT1为红色荧光下观察到的SIRT1表达结果，AcGFP/SIRT1为SIRT1抗体染色(红色)与AcGFP(绿色)荧光细胞重合，Hoechst 33342为对照，结果表明AcGFP与SIRT1同时得到了表达，目的基因gSirt1在奶山羊雄性生殖干细胞中成功表达。

4、Sirt1促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖

对gSirt1成功表达的精原干细胞分别进行RT-PCR、Western blot检测。如图4-1所示为定量PCR检测超表达Sirt1细胞中的Sirt1和PLZF，其中gSirt1基因相对表达量达125倍，Plzf的相对表达量上调了56倍；图4-2所示为定量PCR检测超表达Sirt1细胞中的Myc、PCNA、CCNA1、CCND1，其中Myc相对表达量上调了2.5倍，PCNA相对表达量上调了5倍，CCNA1相对表达量上调了4.5倍；图4-3为Western Blot检测超表达Sirt1细胞中的SIRT1、PLZF、OCT4和MYC，可以明显发现Sirt1、PLZF表达显著上调，而OCT4和MYC的表达也明显上调。

在精原干细胞中，Plzf和Oct4是非常重要的自我更新和多能性相关基因。而在奶山羊精原干细胞中超表达Sirt1后，检测发现奶山羊精原干细胞中的自我更新和多能性相关基因Oct4和Plzf均表达上调(图4-1，图4-3所示)，细胞增殖相关基因Myc、PCNA和细胞周期蛋白CCNA1也上调表达(图4-2，图4-3所示)。而这些相关基因的表达上调显然会促进奶山羊精原干细胞的自我更新和多态性的维持。

细胞周期的流式细胞术检测进一步发现，在奶山羊精原干细胞中超表达Sirt1后，处于G1/G0期的细胞显著性减少，而处于S期的细胞显著性增多。如图5所示，其中A为奶山羊精原干细胞转染pSirt1-IRES2-AcGFP后的细胞周期；B为奶山羊精原干细胞转染pIRES2-AcGFP后的细胞周期；C为奶山羊精原干细胞的细胞周期；D为A、B和C图中的数据统计，结果显示G1/G0期、S期细胞数具有统计学差异，而S期细胞数量的增多也表示细胞增殖加快。

以上结果说明在奶山羊精原干细胞中超表达Sirt1后，奶山羊精原干细胞的自我更新能力增高，细胞增殖加快，Sirt1在奶山羊精原干细胞中也能发挥调节和维持自我更新和多能性的作用，能在构建永生化奶山羊精原干细胞的研究中发挥潜在的积极作用。