抗MERS-CoV核蛋白单克隆抗体生物学特性研究

摘要

目的：分析鉴定32株抗MERS-CoV NP鼠源性单克隆抗体的结合特性及表位；初步建立基于优化配对的单克隆抗体检测MERS-CoV NP的方法。　　方法：　　（1）通过pVRC载体构建表达MERS-CoV NP（1242bp）全长及截短型NP（1-501bp,502-741bp,742-1242bp）的真核表达质粒，并利用免疫荧光的方法鉴定单克隆抗体的结合区域。　　（2）制备32株抗MERS-CoV NP的鼠源性单克隆抗体，通过两种方法（饱和硫酸铵方法，饱和硫酸铵方法和Protein G）纯化单抗，并通过SDS-PAGE电泳与ELISA方法对纯化后单抗进行纯度和结合活性验证。　　（3）利用纯化的不同冠状病毒（MERS-CoV,SARS-CoV,HCoV-229E,-OC43,-HKM1,FCoV,CCoV）NP蛋白，通过ELISA，蛋白免疫印迹等方法对32株单克隆抗体进行了结合活性和特异性分析。　　（4）通过MERN-CoV NP肽库与肽包被ELISA，寻找部分单克隆抗体的结合表位。　　（5）利用近红外线荧光侧流免疫层析检测平台，筛选单抗配对，并结合HRP标记抗体双抗体夹心ELISA方法，初步探索MERS-CoV NP单克隆抗体在血清学方面的应用。　　结果：　　（1）成功构建了表达NP及截短型NP的真核表达质粒，并对32株抗MERS-CoV NP单克隆抗体进行了结合区域的划分，其中22株与N1反应，10株与N3反应。　　（2）制备纯化获得32株抗MERS-CoV NP的鼠源性单克隆抗体；饱和硫酸铵纯化的抗体纯度与活性很高，然后经Protein G再次纯化纯度更高，但得率损失量大。　　（3）抗MERS-CoV NP的单克隆抗体与MERS-CoV的结合力可达到纳克级别（1~10ng），在32株抗MERS-CoV NP的单克隆抗体中，26株单抗为特异性单抗，6株单抗与其他冠状病毒存在交叉反应，其中4株单抗与OC43及HKM1NP反应，1株仅与OC43NP反应，1株与SARS NP反应。　　（4）通过肽库分析，发现单抗mN8结合肽段为EQRVQGSITQRTRTR。　　（5）筛选出3组与MERS-CoV NP结合力强的单克隆抗体配对，检测下限达500pg；再通过HRP标记单克隆抗体，初步建立基于双抗体夹心法，其中1对单克隆抗体检测MERS-CoV NP的检测下线达0.16ng，检测灭活MERS-CoV下限达600PFU/ml。　　结论：32株抗MERS-CoV的小鼠单克隆抗体呈不同的结合特性，特异性单抗可用于建立检测MERS-CoV NP的方法,其他单抗可为冠状病毒NP的结构与功能分析及广谱疫苗研发提供参考。

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