抗埃博拉病毒和马尔堡病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

摘要

本研究分别将埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)核蛋白(NP)基因(enp、mnp)克隆入原核载体pET-32a(+)中，同时将链球菌抗生物素标签(sbp)引入mnp3’端并克隆到原核载体pET-20b(+)中。经酶切鉴定和序列测定，重组质粒pET-32a(+)-enp、pET-32a(+)-mnp和pET-20b(+)-ms构建成功，然后将重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)qb进行表达。SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白EBOV-NP-Trx-His(ETH)、MARV-NP-Trx-His(MTH)和MARV-NP-SBP(MS)分子量分别为116kDa、108kDa、98kDa。经Westernblot分析表明，抗His标签单抗与重组蛋白ETH和MTH上的His标签均能发生特异性反应，抗MARV-NP(MNP)单抗可与MTH和MS发生特异性反应，说明重组蛋白ETH、MTH和MS都成功表达，且MTH和MS与抗MNP单抗具有良好的免疫反应性。 分别以重组ETH和MTH为抗原免疫BALB/c小鼠，3次加强免疫后经细胞融合、间接ELISA法双筛选和3次有限稀释法连续克隆后，最终获得3株抗ENP的特异性杂交瘤细胞(3G8、4B4、4C12)和3株针对MNP的杂交瘤细胞(1H4、2G1、3B5)。除单抗3G8的亚类为IgG2aK外，其它的皆为IgGD1κ。3G8、4B4、4C12、1H4、2G1、3B5细胞培养液上清和腹水的ELISA效价分别为1:2.560×103、1:2.560×103、1:2.560×103、1:6.400×103、1:6.400×103、1:1.280×104和1:1.638×107、1:8.192×106、1:8.192×106、1:1.024×106、1:4.096×106、1:8.192×106。Westernblot分析表明，抗ENP的3株单抗与MTH无交叉反应性，抗MNP的3株单抗则与ETH无交叉反应性，且6株单抗与His标签和Trx标签都无反应，说明这6株单抗均具有良好的特异性。经辛酸-硫酸铵法纯化后，获得的单抗3G8、4B4、4C12、1H4、2G1、3B5的浓度分别为4.584mg/mL、4.822mg/mL、10.000mg/mL、0.713mg/mL、1.166mg/mL、3.702mg/mL。亲和力实验表明，单抗3G8、4B4、4C12与ETH的亲和力常数(Kaff)分别为2.023×109L/mol、1.633×109L/mol、1.607×109L/mol；单抗1H4、2G1、3B5与MTH的Kaff分别为1.100×109L/mol、1.235×109L/mol、1.408×109L/mol。指数相加实验结果表明，抗ENP单抗4B4与4C12识别相同的抗原表位，3G8与4B4或4C12识别的抗原表位则不相关；抗MNP单抗1H4、2G1、3B5识别相同的抗原表位。这些特异性单抗的成功制备分别为EBOV和MARV的诊断奠定了物质基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

1前言

1.1病原学特性

1.1.1病毒形态和结构

1.1.2分子生物学特征

1.1.3生物学特性

1.2流行病学

1.2.1病毒自然宿主及传播途径

1.2.2流行特征

1.2.3流行概况

1.3临床症状与病理改变

1.3.1临床症状

1.3.2病理变化

1.4实验室检验

1.4.1电镜检查

1.4.2病毒分离

1.4.3核酸检测

1.4.4血清学诊断

1.4.5抗原检测

1.5 防治

1.5.1治疗

1.5.2疫苗

1.6重组蛋白和单克隆抗体在EBOV和MARV方面的应用

1.7本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1试验材料

2.1.1主要仪器和耗材

2.1.2菌株、质粒及单抗

2.1.3动物与细胞

2.1.4主要试剂

2.1.5主要试剂溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1 enp、mnp和ms基因克隆及重组质粒构建

2.2.2重组蛋白ETH、MTH和MS的诱导表达及鉴定

2.2.3重组蛋白的纯化

2.2.4动物免疫

2.2.5重组蛋白ELISA工作条件的优化

2.2.6杂交瘤细胞株的建立

2.2.7单抗腹水的生产

2.2.8单抗的纯化

2.2.9单克隆抗体特性的鉴定

3结果与分析

3.1基因克隆及重组质粒

3.1.1 enp、mnp和ms基因的扩增产物

3.1.2 pET-32a(+)-enp、pET-32a(+)-mnp和pET-20b(+)-ms重组质粒

3.2重组蛋白ETH、MTH和MS的诱导表达

3.3大量制备重组蛋白ETH、MTH和MS

3.4重组蛋白ELISA条件的优化

3.5单抗的筛选及杂交瘤细胞株

3.6细胞培养上清及腹水的效价

3.7单抗Ig亚类

3.8单抗的特异性

3.9大量制备和纯化单抗

3.10单抗相对亲和力

3.11单抗识别的抗原表位初步分析

4讨论

4.1蛋白的表达纯化

4.2动物免疫效果

4.3筛选方法

4.4细胞融合

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢