14-3-3ε与Cdc25B在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用研究

摘要

目的：细胞分裂周期25(cell division cycle25，Cdc25)蛋白家族是一种双重特异性磷酸酶，参与细胞周期的调控。Cdc25家族包括三种磷酸酶，分别是Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C。有研究表明Cdc25B是有丝分裂过程中最主要的启动者。14-3-3是一种高度保守的酸性蛋白家族，能够特异性地与磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基结合，参与了多种信号转导途径。对爪蟾卵母细胞的研究表明，蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）可直接磷酸化Cdc25C的第287位丝氨酸，此位点磷酸化后导致了14-3-3蛋白与之结合，从而使Cdc25C活性受到抑制，最终导致卵母细胞发生G2期阻滞。小鼠卵母细胞的研究表明，Cdc25B-Ser321被PKA磷酸化后，通过与14-3-3ε结合，二者共定位于细胞质中，Cdc25B不能穿梭进入细胞核，不能使Cdc2-Tyr15脱磷酸化，因而不能激活成熟促进因子(Maturation Promoting Factor,MPF),导致了卵母细胞阻滞于GV期。Uchida S等的研究也证实14-3-3ε、β与人的Cdc25B第309位磷酸化的丝氨酸结合，致使Cdc25B定位于细胞质中。Xiao等的研究证实，当Cdc25B的第149位丝氨酸突变为丙氨酸时可提高小鼠一细胞期的卵裂率，而且149位丝氨酸在G1、S期是磷酸化的，在G2、M期是脱磷酸化的。我们前期的研究已证实小鼠一细胞期受精卵有14-3-3ε的表达，并且在G1、S期，14-3-3ε和Cdc25B共定位于细胞质；在G2期， Cdc25B进入细胞核；在M期，Cdc25B又均匀地分布于整个细胞。综合上述资料，暗示在小鼠一细胞期受精卵的G1、S期，14-3-3ε和Cdc25B的第149位磷酸化的丝氨酸结合使Cdc25B不能入核激活MPF,因而受精卵阻滞于G2期。为了验证上述假设，我们以小鼠一细胞期受精卵作为研究对象，通过显微共注射14-3-3ε和Cdc25B（野生型和突变型）的mRNAs，以观察它们对小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换的影响。本研究通过免疫共沉淀实验来确定14-3-3ε与Cdc25B是否存在相互作用以及具体的作用位点，这为进一步研究14-3-3ε与Cdc25B在小鼠一细胞期受精卵发育过程中的分子调控机制提供理论依据。对小鼠受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究，将有利于揭示哺乳动物生殖发育的调控机制，从而进一步了解细胞生长、发育、分化以及癌变、凋亡的分子机制，这对以后人类辅助生殖，以及农牧业繁殖有着重要的社会实用价值。　　方法：⑴小鼠超排卵以及收集G1、S、G2、M四个时相的小鼠一细胞期受精卵；⑵将构建的表达质粒体外转录成mRNA，用于显微注射；⑶mRNA的显微注射,观察对受精卵发育的影响；⑷Western Blotting检测Cdc2-Tyr15的磷酸化状态；⑸放射免疫测定MPF的活性；⑹荧光质粒的细胞核注射，观察目的蛋白的亚细胞定位；⑺直接免疫荧光观察目的蛋白的亚细胞定位；⑻免疫共沉淀确定14-3-3ε与Cdc25B是否存在相互作用以及具体的作用位点。　　结果：①14-3-3ε mRNA和Cdc25B-S149A mRNA共注射组，在hCG注射后29.5-30h开始出现卵裂，hCG注射后33h，受精卵的卵裂率是91.0％，而14-3-3ε mRNA单独注射组和14-3-3ε mRNA和Cdc25B-(WT或S149D) mRNA共注射组的卵裂率为零。②14-3-3ε mRNA和Cdc25B-S149A mRNA共注射组的MPF活性呈现周期性波动，在hCG注射后29h开始升高，在hCG注射后30h达到峰值，之后又开始缓慢下降；而在14-3-3ε mRNA单独注射组和14-3-3ε mRNA和Cdc25B-(WT或S149D) mRNA共注射组MPF活性一直保持较低的水平。14-3-3ε mRNA和Cdc25B-S149A mRNA共注射组，hCG注射后29h可以检测到强的磷酸化信号，而在hCG注射后30h已检测不到Cdc2-Tyr15的磷酸化信号；而14-3-3ε mRNA单独注射组和14-3-3ε mRNA和Cdc25B-(WT或S149D) mRNA共注射组在hCG注射后33h仍然可以检测到Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。③直接免疫荧光观察，在受精卵的G2早期和晚期，14-3-3ε的红色荧光信号和Cdc25B-WT的绿色荧光信号均匀地分布于细胞质中；但是G2晚期Cdc25B-S149A的绿色荧光信号主要集中于细胞核，并且在核内的荧光信号明显增强。④免疫共沉淀实验结果显示：14-3-3ε可以与Cdc25B-WT和Cdc25B-S149D结合，当Cdc25B的第149位的丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala）时，14-3-3ε不能和Cdc25B-S149A发生结合。　　结论：⑴14-3-3ε和Cdc25B存在相互作用，调控着受精卵的发育；14-3-3ε可以与Cdc25B的第149位丝氨酸结合，使Cdc25B定位于细胞质中，不能进入细胞核激活MPF,从而导致受精卵阻滞于G2期。⑵14-3-3ε调控着Cdc25B的细胞内定位，Cdc25B的第149位丝氨酸对Cdc25B的细胞内定位起着关键的作用。⑶Cdc25B的第149位丝氨酸是14-3-3ε的结合位点。14-3-3ε可以与Cdc25B-WT和具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S149D结合，而不与不能磷酸化的Cdc25B-S149A结合。进一步证实14-3-3ε能与Cdc25B第149位磷酸化的丝氨酸结合，使Cdc25B定位于细胞质而不能入核激活MPF，14-3-3ε调控受精卵G2/M期的转换。

目录

声明

前言

1.材料与方法

1.2质粒、菌株及相关分子生物学试剂

1.3主要的实验仪器设备

1.4主要试剂配制

2. 实验方法

2.1 小鼠一细胞期受精卵的采集和培养

2.2 表达载体的构建及鉴定

2.3 质粒的扩增及提取

2.4 体外转录

2.5 mRNA显微注射

2.7 MPF活性的测定

2.8 Western Blotting

2.9直接免疫荧光实验观察外源性14-3-3ε 和Cdc25B蛋白的亚细胞定位

2.10 荧光质粒的细胞核注射

2.11 细胞培养和转染

2.12细胞裂解，免疫沉淀和免疫印迹

2.13 数据处理

3.结果

3.1. 目的片段14-3-3ε 和Cdc25B-WT 、Cdc25B-S149A 、Cdc25B-S149D的PCR扩增结果

3.2 pCDNA3.1-3xflag-Cdc25B-WT、 pCDNA3.1-3xflag-S149A、pCDNA3.1-3xflag-S149D和pCMV-myc-14-3-3ε 重组质粒的构建

3.3 显微注射14-3-3ε 和Cdc25B 的mRNA 对小鼠一细胞期受精卵发育的影响

3.4 直接免疫荧光实验观察外源性的14-3-3ε 和Cdc25B的亚细胞定位

3.5 免疫共沉淀测定14-3-3ε 和 Cdc25B的相互作用

4. 讨论

5.结论：

6.展望：

参考文献

文献综述:Cdc25与14-3-3相互作用的研究进展

缩 略 语 表

攻读学位期间发表文章情况

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