HCPT/PEG-PLA胶束制备及其抗肿瘤作用和HPLC-MS测定体内HCPT含量的方法学建立

摘要

第一部分 HCPT/PEG-PLA纳米胶束中HCPT含量测定的方法学建立　　目的：建立测定HCPT/PEG-PLA纳米胶束包封率的方法。　　方法：采用紫外分光光度法测定HCPT/PEG-PLA纳米胶束中HCPT含量。配制HCPT标准品溶液，进行波普扫描，确定吸收波长。取配好的一系列不同浓度的溶液用紫外分光光度计在确定波长处测定吸光度，绘制标准曲线，并进行精密度和回收率考察。　　结果：经紫外扫描确定药物吸收波长为384nm，且载体在此波长处无吸收，不干扰测定。药物浓度在2.0-7.0ug/ml范围内线性关系良好，回归方程为:y=0.1127x-0.015(R=0.9995)，日内、日间精密度均小于5％，平均回收率为99.4%。　　结论：紫外测定HCPT/PEG-PLA纳米胶束的包封率符合方法学要求，简便、可行。　　第二部分 HCPT/PEG-PLA纳米胶束的制备及表征　　目的：本部分拟制备两亲型嵌段共聚物聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米载药胶束，并装载难溶性闭环羟基喜树碱（HCPT）。通过胶束包裹稳定HCPT的内酯结构、增加溶解性、延长半衰期，提高缓释性和靶向性。　　方法：采用溶剂挥发法制备HCPT/PEG-PLA纳米胶束。紫外分光光度计测定包封率。采用单因素考察试验分别考察所用有机溶剂种类、药物与共聚物的质量比和有机相与水相的体积比对HCPT/PEG-PLA纳米胶束粒径和包封率的影响。采用正交设计试验,以有机溶剂种类、HCPT与PEG-PLA的质量比和有机相与水相的体积比作为影响因素,以包封率为评价指标,采用正交表L9(34)进行试验设计,优化处方。采用激光粒度分析仪测定最优处方HCPT/PEG-PLA纳米胶束的粒径及其分布。　　结果：成功制备HCPT/PEG-PLA纳米胶束，其粒径及包封率受所用溶剂种类、药物与共聚物质量比和有机相与水相体积比的影响。最佳制备工艺为使用二氯甲烷作为溶剂,药物与聚合物的质量比为1:15,有机相与水相的体积比为2:10。按照最佳工艺得到的HCPT/PEG-PLA纳米胶束平均粒径为(100±3.65)nm，包封率为(68.96±1.41)%。　　结论：本实验以 PEG-PLA为载体材料,HCPT为模型药物,通过溶剂挥发法制备了HCPT/PEG-PLA纳米胶束,并应用单因素考察和正交设计优化处方,选择了最优处方。激光粒度仪测定了粒径分布范围较为理想。　　第三部分HCPT/PEG-PLA纳米胶束对RSCC-1细胞体外抑制实验　　目的：探讨HCPT/PEG-PLA纳米胶束对RSCC-1细胞体外抑制作用。　　方法：兔舌癌RSCC-1细胞复苏和培养，传代至对数生长期进行实验。经与PBS、PEG-PLA空白载体、不同浓度的HCPT和HCPT/PEG-PLA共同培养不同时间后，MTT法检测体外细胞毒作用，计算细胞生长抑制率。　　结果：MTT检测结果显示PEG-PLA载体胶束组对RSCC-1细胞并无细胞毒作用(p>0．05)；HCPT市售剂型组呈现明显细胞毒作用：生长抑制率随药物浓度、作用时间增加而升高；HCPT/PEG-PLA纳米胶束剂型组48h时生长抑制率低于HCPT市售剂型组(p<0.05)，至96h时则与HCPT市售剂型组差别己无统计学差异(p>O.05)。　　结论：　　1.HCPT/PEG-PLA纳米胶束对RSCC-1细胞具有直接抑制作用，呈现时间、剂量依赖性。　　2.HCPT/PEG-PLA纳米胶束具有缓释性。　　第四部分HPLC-MS测定体内HCPT含量的方法学考察　　目的：考察并建立测定体内HCPT含量的HPLC-MS法。　　方法：采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术,建立新西兰白兔组织及血浆中HCPT含量的检测分析方法。通过优化样品的前处理条件(包括去蛋白方法、匀浆介质、酸量、蛋白沉淀剂等)与液相条件,确定生物样品处理的最佳条件。并考察了组织及血浆的方法专属性、精密度、重复性、稳定性、制定标准曲线、测定回收率。　　结果：成功建立了新西兰白兔组织及血浆中HCPT含量的检测分析方法。通过优化样品的前处理条件与液相条件，确定釆用蛋白沉淀法处理样本，以生理盐水为匀浆介质，甲酸量为20ul，乙腈为蛋白沉淀剂，乙腈与样本量比例为2:1，蛋白沉淀后进行超声为样本最佳制备条件。甲醇-水(0.1%甲酸)作为流动相为质谱的最佳色谱条件。液质联用测定组织及血浆中HCPT的方法专属性好，组织样本和血浆样本精密度的RSD都小于5%，重复性和稳定性的RSD都小于10%。组织内HCPT含量在50～6000 ng/100mg范围内线性关系良好，标准曲线方程为：Y=1381.2X-124.77（R=0.9995），平均回收率为75.76%。血浆内HCPT含量在1～20000 ng/ml范围内，标准曲线方程为：Y=354.73X2+2774.9 X-6.1646(R=0.9999)，平均回收率为78.65%。　　结论：本实验成功建立了检测组织及血浆中HCPT含量的HPLC-MS法，其方法专属性好，精密度、重复性、稳定性、回收率符合生物样本检测标准。能够满足后续实验验证HCPT／PEG-PLA纳米胶束靶向治疗兔舌癌移植瘤时组织及血浆内HCPT含量的测定。

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前言

第一部分HCPT/PEG-PLA纳米胶束中HCPT含量测定的方法学建立

1. 实验材料

2. 方法与结果

3. 讨论

4. 结论

第二部分HCPT/PEG-PLA纳米胶束的制备及表征

1. 实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第三部分HCPT／PEG-PLA纳米胶束对RSCC-1细胞体外抑制实验

1. 实验材料

2．实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

5. 结论

第四部分HPLC-MS测定体内HCPT含量的方法学考察

1. 实验材料

2. 实验方法：

3. 实验结果

4. 组织HPLC-MS方法学考察

5. 血浆HPLC-MS方法学考察

6. 讨论

7. 结论

参考文献

文 献 综 述

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