RASSF7通过Coiled-coil结构抑制Hippo信号通路促进NSCLC增殖与侵袭

摘要

肺癌是恶性肿瘤中导致死亡的主要原因之一，尽管近年来肺癌的治疗已经取得了较大的进步，但是由于表观遗传等复杂因素在肿瘤的生长和侵袭中起着重要的作用，患者长期生存率仍旧不高。因此，发现新的癌基因/抑癌基因并阐明其作用机制是防治肿瘤的重要任务。近年来Hippo信号通路与肿瘤的发生、进展的关系备受重视。Hippo信号通路的作用在于通过控制蛋白分布和蛋白水平来调控YAP/TAZ的功能。因此，YAP转位入核是该通路失活的核心过程。Ras相关结构域家族(Ras-association domain family，RASSF)由十名成员组成，即经典的RASSF1-6和N-端的RASSF7-10。前者均含C-端SARAH结构域（Sav/RASSF/Hippo）和中间的RA结构域，后者只有N-末端的RA结构域，并且在其C-末端并不存在SARAH结构域。只是最近才有人预测，在RASSF7，RASSF8和RASSF10的C-末端中可能存在另一种卷曲双螺旋结构(Coiled-coil domain)，而且预测它可能具备SARAH结构域的功能。最近的研究表明:经典的Ras相关结构域家族与Hippo通路密切相关。RA结构域位于N-末端并缺少SARAH结构域的非经典的RASSF7的生物学作用和机制是否也同Hippo通路有关？这引起了我们的极大兴趣。　　目的:　　本研究中，我们通过检测RASSF7在非小细胞肺癌组织和肺癌细胞中的表达及与临床病理因素、预后之间的关系，并通过体内体外两种实验观察了RASSF7的生物学功能，通过构建和转染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多种RASSF7的突变体，旨在阐明RASSF7在非小细胞肺癌中发挥作用的可能机制。　　方法:　　收集88例中国医科大学附属第一医院行手术治疗切除并具有完整随访资料的非小细胞肺癌患者的癌组织及20例癌旁正常组织(距癌组织5cm)石蜡包埋标本。另外收集2016年手术切除的24例新鲜肺癌组织标本。免疫组织化学检测RASSF7在非小细胞肺癌中的表达，分析其与临床病理因素及不良预后之间的关系;Western blot和qPCR检测肺癌组织及肺癌细胞系中RASSF7表达情况;分别在RASSF7相对表达量高或低的细胞系中敲除或过表达RASSF7，通过MTT、克隆形成实验、基质胶侵袭实验和Western blot探讨RASSF7对肺癌细胞增殖与侵袭及相关蛋白的影响;Western blot、荧光素酶报告基因及qPCR检测肺癌细胞中敲除或过表达RASSF7对Hippo信号通路及下游靶基因CTGF和Cyr61mRNA表达水平的影响;通过构建和转染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多种RASSF7的突变体，观察RASSF7突变体对肺癌细胞的影响，并通过皮下和尾静脉注射到裸鼠体内，探讨RASSF7发挥作用的可能机制。　　结果:　　1、与癌旁正常肺组织中RASSF7低表达、几乎为阴性表达相比，非小细胞肺癌组织中呈高表达RASSF7主要定位于胞浆。新鲜配对肺癌组织中RASSF7蛋白及mRNA的表达明显高于其配对的癌旁组织。RASSF7的胞浆高表达与肺癌患者高TNM分期和淋巴结转移正相关，RASSF7的胞核高表达与肺癌患者的各临床病理因素间无明显相关性。生存分析显示RASSF7总表达、胞浆高表达的非小细胞肺癌患者生存时间明显低于RASSF7胞浆阴性表达的非小细胞肺癌患者的生存时间，RASSF7胞核高表达的患者生存时间与RASSF7胞核低表达的患者生存时间相似。RASSF7胞浆高表达是非小细胞肺癌患者预后独立危险因素。　　2、在A549和H1299细胞系中分别转染和干扰，发现转染RASSF7质粒促进了细胞的增殖和侵袭（P＜0.05），提高了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表达水平，降低了P21蛋白表达水平。而转染RASSF7-ShRNA后抑制了细胞增殖与侵袭，显著降低了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表达，升高了P21蛋白表达水平。　　3、转染RASSF7质粒后可以明显提高Hippo通路转录子TEAD的转录活性、降低核心成员MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平，下游靶基因CTGF蛋白表达增多，同时，CTGF和Cyr61的mRNA表达也明显升高;反之，敲除RASSF7时Hippo通路转录子TEAD的转录活性、核心成员MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平、游靶基因CTGF蛋白表达及CTGF和Cyr61的mRNA表达(P＜0.01)均呈现相反的结果。我们对转染RASSF7质粒的细胞进行核/浆分离提蛋白，Western blot结果显示过表达RASSF7后细胞核中的YAP蛋白表达明显增加，敲除RASSF7降低细胞核内YAP蛋白的表达。免疫荧光也证明了这一点。RASSF7过表达组同时敲除YAP时，上述指标表达均被恢复。　　4、我们在证实了RASSF7能与MST1结合并且观察到二者存在共定位的基础上，用RASSF7的4种剪接体转染A549细胞，发现只有去除Coiled-coil结构域的R7-Mut4不能与MST1结合，说明二者正是通过Coiled-coil结构域相结合来发挥作用的。为了进一步验证上述结论，我们在A549细胞中转染RASSF7及其剪接体质粒后，分别检测了转染RASSF7及其剪接体后Hippo通路核心蛋白、Hippo通路转录子TEAD的转录活性、细胞增殖及侵袭的变化。结果显示:与RASSF7及其他三个剪接体组相比，只有R7-Mut4过表达组细胞的MST1、LATS及YAP等核心蛋白的磷酸化水平出现明显回升;转录子TEAD的转录活性显著降低;细胞的增殖能力下降;细胞的迁移、侵袭能力也被抑制。充分说明RASSF7通过Coiled-coil结构域与MST1结合，从而通过Hippo信号通路发挥作用。而RA结构域去除2个Coiled-coil结构域中的1个，对RASSF7的功能影响不大。　　5、将转染空载体、RASSF7质粒、RASSF7-Mut4的细胞经皮下或尾静脉注射裸鼠体内，发现与转染空载体组和转染RASSF7-Mut4组相比，转染RASSF7质粒组的移植瘤体积和质量均有明显提高，其在肺内的转移瘤病灶数量也明显增多。免疫组织化学检测发现转染RASSF7质粒组的Ki-67蛋白的表达均显著增加，同时YAP转位入核增加，;而转染R7-Mut4组无论是移植瘤的体积、质量、Ki-67及RASSF7蛋白的表达，还是肺转移瘤的数量及YAP核定位均较转染RASSF7质粒组有显著下降，且接近于NC组，进一步证明了RASSF7发挥作用依赖于Coiled-coil结构域。　　结论:　　1、RASSF7在非小细胞肺癌中高表达并与预后相关;　　2、体内外实验证明过表达RASSF7促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭;　　3、RASSF7通过抑制Hippo通路促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭;　　4、RASSF7的生物学功能依赖于Coiled-coil结构域的存在。

目录

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摘要

英文缩略语

第一部分：RASSF7在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖与侵袭的影响

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验对象、材料与试剂

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分：RASSF7通过Coiled-coil结构抑制Hippo信号通路促进NSCLC增殖与侵袭

1 前言

2．1 材料与试剂

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 N-端RASSF家族RASSF7-RASSF10的研究概述

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历