Lewisy抗原通过PI3K/Akt及ERK/MAPK信号通路调控卵巢癌细胞增殖相关蛋白表达的机制研究

摘要

前言：　　 卵巢癌的发生与发展是一个极其复杂的多因素的过程,目前对其发生机理尚不清楚。细胞膜表面有许多糖脂、糖蛋白构成的复合物,对细胞-细胞、细胞-分子的识别十分重要,参与信号转导、粘附等分子相互作用,与细胞生长、凋亡、运动、分化等重要生命过程密切相关。细胞癌变后细胞膜上的糖复合物,特别是其糖链部分发生结构和量的变化。卵巢癌主要表现为Ⅱ型糖链的改变,如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出现Lewisy不同程度的过量表达,且表达增高的患者预后不良。我们在前期工作中利用基因转染技术将人α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转入卵巢癌细胞系RMG-I,建立了Lewisy稳定高表达卵巢癌细胞系RMG-I-H,发现转染后RMG-I-H细胞对铂类、紫杉醇及5-FU等化疗药物敏感性下降,提示Lewisy抗原具有提高卵巢癌细胞生存能力的作用。　　 细胞表面的受体几乎都是糖蛋白,研究表明,改变糖基转移酶的表达可影响细胞表面受体的糖链结构,继而影响其表达数目及功能,促进细胞增殖。体细胞通过跨越紧密调节的细胞周期进行增殖和分化,细胞周期的调控涉及一系列调控蛋白,这些蛋白表达量及活性的变化在周期调控中极为重要。我们在前期工作中利用基因芯片技术检测α1,2-FT基因转染前后细胞系癌相关基因的表达差异,结果显示转染后细胞中有88种差异性表达基因,差异基因主要表现在细胞增殖、信号转导、蛋白氨基酸磷酸化、转录、凋亡等方面。因此,我们推测Lewisy可能作为信号转导通路上的重要结构参与细胞内信号转导,进而影响卵巢癌细胞的生物学行为。　　 本研究主要在前期工作的基础上,利用已经建立的α1,2-FT及Lewisy稳定高表达细胞模型,探讨Lewisy抗原促进卵巢癌细胞增殖的具体作用机制,为研究卵巢癌的发生、发展机制奠定基础,为卵巢癌的早期诊断及靶向治疗提供理论依据。　　 方法：　　 第一部分:用RT-PCR、WesternBlot及免疫共沉淀等方法研究卵巢癌细胞系RMG-I转染α1,2-FT基因前后细胞中胰岛素样生长因子受体-1(Insulin-likegrowthfactorreceptor-1,IGFR-1)与Lewisy基因、蛋白的表达及两者的结构关系,以及抗体阻断前后IGFR-1酪氨酸磷酸化水平的变化;用免疫组化法检测卵巢上皮性恶性、交界性、良性肿瘤和正常卵巢组织中Lewisy抗原与IGFR-1的表达及相关性,并分析其表达与卵巢癌组织学类型、病理分级、临床分期及淋巴结转移等病理参数的关系;利用免疫荧光双标记法检测Lewisy抗原与IGFR-1在卵巢癌组织中表达的相关性。　　 第二部分:利用流式细胞仪分析α1,2-FT基因转染前后细胞的细胞周期;采用Real-timePCR方法检测细胞中Cyclins,CDKs和CKIs的mRNA水平;利用WestemBlot方法检测基因转染前后、Lewisy抗体阻断前后及信号通路抑制剂处理前后细胞中Cyclins,CDKs和CKIs的蛋白表达水平。　　 第三部分:利用RT-PCR、免疫印迹法方法检测α1,2-FT基因转染前后细胞中p27,p-p27,Skp2基因及蛋白的表达;采用免疫共沉淀方法检测p27泛素化水平;利用Westernblot方法检测P13K/Akt和ERK/MAPK信号通路抑制剂LY294002,PD98059和抗Lewisy单克隆抗体处理前后细胞中上述重要分子的变化。　　 结果：　　 第一部分:基因转染后细胞系RMG-I-H中IGFR-1的基因和蛋白表达水平均上调(P均＜0.01),但是,转染后细胞中IGFR-1的酪氨酸磷酸化水平较转染前升高更加明显(P＜0.01)。免疫共沉淀证明Lewisy为IGFR-1结构上的重要组成部分,IGFR-1上的Lewisy总表达量为转染前细胞的1.81倍,而相对表达量几乎无变化(P＞0.05)。在卵巢上皮性恶性肿瘤中,Lewisy抗原的阳性表达率为88.33%,明显高于交界性(60.00%)(P＜0.05)、良性(33.33%)(P＜0.01)及正常卵巢组(0);Lewisy抗原的阳性表达率与卵巢癌临床病理参数无关(P均＞0.05);IGFR-1在卵巢恶性上皮性肿瘤中的阳性表达率为93.33%,明显高于交界性(63.33%)(P＜0.05)、良性(53.33%)(P＜0.05)和正常卵巢组(40%)(P＜0.01);IGFR-1的阳性表达率与临床分期、组织学类型、分化程度及有无淋巴结转移无关(P均＞0.05);在卵巢癌中,Lewisy抗原和IGFR-1的表达水平随临床分期的增加、分化程度的降低而增加,但无统计学意义(P＞0.05),与组织学类型及有无淋巴结转移无关(P＞0.05);Lewisy抗原和IGFR-1在卵巢癌组织中同时高表达,且其表达具有正相关性(P＜0.01)。　　 第二部分:Lewisy抗原能够加快卵巢癌细胞由G1期进入S期。Lewisy高表达导致卵巢癌细胞中CyclinA,CyclinD1和CyclinEmRNA及蛋白表达增加,而p16、p21mRNA及其蛋白表达减少,p27仅蛋白表达降低,其mRNA表达没有改变;CDK2,CDK4和CDK6的mRNA及其蛋白水平在基因转染前后没有变化。Lewisy抗体、ERK和PI3K通路抑制剂PD98059和LY294002能够减少Lewisy高表达引起的Cyelins和CKIs表达差异。　　 第三部分:Lewisy高表达导致p27的核浆分布比例下降,p27蛋白稳定性下降,p27多聚泛素化及p27-Thr187磷酸化水平上调,CDK2活性增强及Skp2表达增加均加快p27蛋白降解,从而导致p27蛋白稳定性降低。Lewisy单克隆抗体阻断可以减少转染前后卵巢癌细胞中p27和Skp2的表达差异。PI3K/Akt通路较ERK/MAPK通路在Lewisy调节p27和Skp2的表达方面起主要作用。　　 结论：　　 1、Lewisy抗原和IGFR-1表达增加与卵巢癌的发生、发展相关;　　 2、Lewisy是IGFR-1的重要结构;其高表达不仅增加IGFR-1的数量,还上调IGFR-1酪氨酸激酶磷酸化水平;通过ERK2MAPK,PI3K/Akt信号通路调节细胞周期相关因子的表达,使细胞增殖加快;加快卵巢癌细胞由静止期进入增殖期;　　 3、Lewisy主要通过PI3K/Akt信号转导通路在翻译后水平调节p27蛋白表达。