miR-26a/26b靶向调控唾液酸糖基转移酶ST8SIA4在乳腺癌增殖及侵袭中的作用

摘要

乳腺癌是女性易发的恶性肿瘤之一，也是造成女性死亡的主要原因。据统计，2012年世界范围内新发病例大约170万，而其中死亡病例就已接近50万[1]。来自中国抗癌协会的统计数字显示，目前我国乳腺癌的发病率以每年3%的速度递增，且呈现年轻化的趋势，而且逐渐成为城市中死亡率增长最快的癌症。因此，为降低乳腺癌患者的死亡率，不仅仅是要早期治疗，更重要的是有效防止其恶性进展。　　乳腺癌是起源于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，原位乳腺癌并不致命，如果能够做到早期发现、早期诊断及早期治疗，乳腺癌或可成为疗效最佳的实体肿瘤之一。但乳腺癌的早期症状往往并不明显，这就使很多患者错失最佳治疗时机，乳腺癌细胞一旦脱离原发病灶，极易通过血液或淋巴液进行播散，形成远处转移，严重影响乳腺癌患者的生存质量和生存率。　　糖链与细胞膜的蛋白质、脂质相连，几乎覆盖细胞膜的整个外表面[2]，它决定了细胞的“面部特征”。唾液酸化修饰是以单磷酸胞苷活化的唾液酸（CMP-Neu5Ac）为底物，经唾液酸糖基转移酶（sialyltransferase，ST）催化，将底物中的唾液酸残基（Neu5Ac）转移到细胞膜糖蛋白或糖脂末端的过程。唾液酸残基（Neu5Ac）以糖苷键连接到糖蛋白或糖脂的糖链末端，根据形成的糖苷键类型的不同，可以将唾液酸糖基转移酶家族分成四大类，共20种亚型。第一类，以α-2,3糖苷键将唾液酸残基连接到糖链末端的半乳糖上，共6种亚型，包括ST3Gal1-6；第二类，以α-2,6糖苷键将唾液酸残基连接到糖链末端的半乳糖上，共2种亚型，包括ST6Gal1-2；第三类，以α-2,6糖苷键将唾液酸残基连接到糖链末端的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）上，共6种亚型，包括ST6GalNAc1-6；第四类，以α-2,8糖苷键将唾液酸残基连接到其他唾液酸（Sia）上，共6种亚型，包括ST8SIA1-6[3]。唾液酸糖基转移酶结构和功能的改变可以直接影响细胞膜糖蛋白和糖脂的唾液酸化糖基化的结构和功能，进而影响细胞的生物学行为。　　唾液酸化修饰是蛋白质糖基化的一种。细胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修饰广泛存在，并且在细胞粘附、抗原识别和信号传导等[4]多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。而唾液酸糖基转移酶的表达及活性的改变，可以直接影响糖链的结构和功能。而糖链结构和功能的改变往往与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。随着对肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学研究的深入，越来越多的证据表明，唾液酸化修饰与恶性肿瘤在其增殖、迁移和侵袭以及逃避机体免疫监视等方面都具有十分重要的作用，唾液酸化修饰的糖链被认为是一种新型的、广谱的肿瘤标志物[5]。　　大量研究表明，唾液酸糖基转移酶在乳腺癌的发生、发展过程中起到重要的作用。如：ST3GAL2的过表达与乳腺癌病人临床化疗疗效密切相关[6]。下调ST6GAL1的表达，可抑制乳腺癌细胞的转移能力[7]。ST6GALNAC1的过表达，可增强乳腺癌细胞的成瘤性[8]。ST6GALNAC5在乳腺癌细胞中的过表达，可增强其对大脑内皮细胞的粘附，从而诱发乳腺癌脑转移[9]。ST8SIA1在雌激素受体阴性乳腺癌的不同亚型中呈现高表达[10]。　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度大约为19-24个核苷酸的、单链非编码的内源性小分子RNA，其基因序列高度保守，在细胞内参与转录后基因的调控。miRNAs通过与靶基因mRNA完全性或不完全性的互补结合，使靶基因mRNA断裂降解或抑制其翻译，从而达到调控靶基因表达的目的。miRNAs的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中同样扮演着关键性的角色。有研究证实，miR-147，miR-340和 miR-1296的异常表达可调控乳腺癌细胞的增殖、凋亡以及转移[11-13]；miR-139-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖，而miR-217的过表达可增强乳腺癌细胞的侵袭能力[14]。　　近来发现，miR-26家族由4个序列相似、结构相仿、种子区序列（UCAAUGA）相同的miRNAs组成，该家族成员主要有miR-26a，miR-26b，miR-1297和miR-4465。包括乳腺癌、肝癌、胃癌在内的多种实体肿瘤，与相应的癌旁组织相比，均可见miR-26a/b低表达，并且与肿瘤的预后、疗效、淋巴结转移以及临床分期等都存在一定的相关性[15]。然而，关于miR-26a/b是否存在对唾液酸糖基转移酶mRNA的靶向调控作用，以及该靶向调控作用如何影响乳腺癌细胞的增殖和侵袭，尚未见相关报道。　　本研究中，通过分析乳腺癌组织及乳腺癌细胞株膜蛋白唾液酸化N-糖链的组成，揭示了唾液酸化与乳腺癌进展的相关性，同时也提供了miRNA调控唾液酸化的新证据。质谱分析表明，与癌旁组织及正常乳腺上皮细胞株MCF-10A相比，在乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，膜蛋白N-糖链的唾液酸化水平显著增高。我们对20种唾液酸糖基转移酶基因进行分析发现，在乳腺癌和癌旁组织中存在显著性差异；在具有不同转移潜能的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7，和正常乳腺上皮细胞MCF-10A间同样存在显著性差异。其中ST8SIA4在乳腺癌组织以及具有高度转移潜能的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中明显高表达。敲除乳腺癌细胞的ST8SIA4可以明显抑制其恶性行为，尤其是可以抑制唾液酸糖基转移酶依赖性的细胞增殖和侵袭。通过生物信息学技术，对 miRNA的靶点ST8SIA43'-UTR端进行预测，可以确定ST8SIA4是miR-26a/26b的靶基因之一。进一步的实验数据显示，在乳腺癌细胞株、乳腺癌组织及癌旁组织中，ST8SIA4和miR-26a/26b的表达呈负相关。通过双荧光素酶报告分析方法可以发现，miR-26a/26b通过与ST8SIA4的3'-UTR的特异性结合，对其进行调控。我们通过转染miR-26a/26b模拟物或抑制物来改变乳腺癌细胞ST8SIA4的表达，发现过表达miR-26a/26b可以降低乳腺癌细胞ST8SIA4的表达水平并且可以影响乳腺癌进展。这些结果显示，唾液酸糖基化水平的改变可以作为乳腺癌进展的有效标志，此外，miR-26a/26b可以通过靶向作用ST8SIA4广泛参与对唾液酸糖基化机制的调控。　　第一部分质谱分析乳腺癌组织和细胞株表面N-糖链的组成差异　　目的：　　通过质谱分析乳腺癌组织、癌旁组织、乳腺癌细胞株（MDA-MB-231）、人乳腺上皮细胞株（MCF-10A）细胞表面N-糖链的组成，发现差异表达的N-糖链以及唾液酸化的N-糖链。　　方法：　　提取组织和细胞株的膜蛋白，并制备甲基化N-糖链。使用MALDI-TOF质谱仪，应用FlexControl3.4软件系统（Bruker-Daltonics，Germany）分析乳腺癌组织与癌旁组织、MDA-MB-231与MCF-10A之间膜蛋白N-糖链的差异。　　结果：　　（1）在乳腺癌组织和癌旁组织中共有32种N-糖链的表达，信号峰3,5,6,7,11,12,14,15,16,28,35和36只在乳腺癌组织中表达，其中信号峰35为唾液酸化N-糖链（Figure1B，Table4）。另外，与癌旁组织相比，信号峰13,17,18,23,32和33在乳腺癌组织中见显著增强（>2 fold），其中23和32为唾液酸化N-糖链（Figure1B，Table4）。　　（2）在MDA-MB-231和MCF-10A中共有33种N-糖链的表达，信号峰22,29,37和40只在MDA-MB-231特异性地表达，且和唾液酸化密切相关。除此之外，与MCF-10A相比，信号峰1,4,5,10,11,15,16,18,21,25,26,27,31,32,33,34,35,38和39（>2 folds）在MDA-MB-231中显著增强（Figure2B），其中信号峰25,27,32,33,34,35,38和39与唾液酸化密切相关（Table4）。　　结论：　　（1）乳腺癌组织和癌旁组织的膜蛋白N-糖链的组成存在明显差异，且差异表达的N-糖链与唾液酸化密切相关。　　（2） MDA-MB-231和MCF-10A细胞膜蛋白N-糖链的组成存在明显差异，且差异表达的N-糖链与唾液酸化密切相关。　　（3）以上结论表明，唾液酸化的N-糖链异常表达与乳腺癌的发展密切相关。　　第二部分实时荧光定量PCR检测组织和细胞株唾液酸糖基转移酶(ST)基因mRNA的表达及ST8SIA4在组织及细胞株中蛋白的表达　　目的：　　通过检测乳腺癌组织与癌旁组织、乳腺癌细胞株（MDA-MB-231、MCF-7）与人乳腺上皮细胞株（MCF-10A）ST基因家族mRNA的表达，发现差异表达明显的唾液酸糖基转移酶。　　方法：　　通过实时荧光定量PCR技术筛选出MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A间，乳腺癌组织及癌旁组织间差异表达明显的ST基因；并通过免疫组织化学染色和western-blot技术对筛选出的差异表达ST进行验证。　　结果：　　（1） ST6GALNAC5(2.31 folds)，ST8SIA3(1.78 folds)和ST8SIA4(2.47 folds) mRNA在乳腺癌组织中高表达(Figure3B，C)。　　（2）与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，ST6GALNAC5(7.33 folds)，ST8SIA4(14.81 folds)和ST8SIA5(3.11 folds) mRNA在MDA-MB-231细胞中的表达明显增高(Figure4B，C)；与侵袭性较弱的乳腺癌细胞系MCF-7相比，ST3GAL6(12.34 folds)和 ST8SIA4(5.71 folds) mRNA在 MDA-MB-231细胞中的表达明显上调(Figure4A，C)。　　（3）免疫组织化学染色显示，与癌旁组织相比，ST8SIA4在乳腺癌组织中呈现高表达（Figure5A）。免疫荧光染色显示，与 MCF-7相比，ST8SIA4在MDA-MB-231细胞中呈现高表达（Figure5A）。　　（4）Western blot结果显示，与低转移潜能MCF-7细胞相比，ST8SIA4蛋白在MDA-MB-231细胞中呈现高表达（Figure5B）。　　结论：　　ST8SIA4在MDA-MB-231中表达明显升高，在MCF-7和MCF-10A中轻度表达，其差异表达最为显著。ST8SIA4在乳腺癌组织和癌旁组织中差异表达最为明显。这表明，唾液酸糖基转移酶ST8SIA4可能与乳腺癌的恶性进展相关。　　第三部分特异性下调MDA-MB-231细胞中的ST8SIA4的表达，观察其对乳腺癌细胞体外的增殖和侵袭能力、体内成瘤性的影响　　目的：　　特异性下调MDA-MB-231细胞中高表达的ST8SIA4，检测ST8SIA4下调后的MDA-MB-231细胞在体外增殖和侵袭能力以及在小鼠体内成瘤能力的变化。　　方法：　　沉默MDA-MB-231细胞中的ST8SIA4基因后，采用CCK-8细胞增殖实验、划痕试验、transwell试验及体内成瘤试验，检测其体外增殖能力和侵袭能力以及体内成瘤能力的变化。　　结果：　　（1）与转染control shRNA相比，转染ST8SIA4 shRNA的MDA-MB-231细胞中的ST8SIA4的蛋白水平明显降低，且具有显著性差异（Figure6，*P<0.05）。　　（2）CCK-8细胞增殖实验结果显示，沉默ST8SIA4基因的MDA-MB-231细胞的体外增殖受到明显抑制(Figure7)。划痕试验和transwell实验结果显示，与对照组相比，特异性下调MDA-MB-231细胞中的ST8SIA4后，细胞体外迁移、侵袭能力均明显下降（Figure8A，B）。　　（3）体内成瘤试验显示，与对照组相比，注射ST8SIA4 shRNA细胞的小鼠成瘤体积明显减小（Figure9，*P<0.05）。　　结论：　　特异性下调MDA-MB-231细胞中ST8SIA4后，该细胞体外增殖受抑、侵袭能力明显下降。小鼠体内成瘤实验中，平均成瘤体积明显低于对照组。　　第四部分 miR-26a和miR-26b对ST8SIA4靶向调控作用　　目的：　　通过检测组织和细胞株中miR-26a/26b的表达，分析其与ST8SIA4表达的潜在相关性。　　方法：　　定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术分析乳腺癌组织及癌旁组织中，MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A的miR-26a和miR-26b的表达情况。采用qRT-PCR分析乳腺癌组织、癌旁组织的ST8SIA4 mRNA与miR-26a/26b表达水平及相关性。特异性上调MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下调MCF-7中的miR-26a/26b，检测过表达、干扰前后，细胞中ST8SIA4的mRNA及其蛋白表达情况。采用双荧光素酶实验验证miR-26a/26b对ST8SIA4的靶向调控功能。　　结果：　　（1）qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中miR-26a/26b的表达水平明显下降（Figure10A）。与MCF-7和MCF-10A相比，MDA-MB-231细胞的miR-26a/26b表达水平明显下降（Figure10B）。且在乳腺癌组织和癌旁组织中，ST8SIA4 mRNA的表达水平与miR-26a/26b的表达水平呈负相关（Figure11），在乳腺癌细胞株中的表现亦如此。　　（2）特异性上调MDA-MB-231中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及其蛋白表达水平明显下降（Figure12A，B）。特异性下调MCF-7中的miR-26a/26b的后，ST8SIA4的mRNA及蛋白表达水平明显升高（Figure12C，D）。　　（3）双荧光素酶报告基因实验结果显示，与对照组相比，ST8SIA4WT3’-UTR+ miR-26a/26b mimic组荧光素酶活性显著降低，而 ST8SIA4MUT3’-UTR+miR-26a/26b mimic组荧光素酶活性没有明显变化（Figure13）。　　结论：　　ST8SIA4为miR-26a和miR-26b的靶基因。miR-26a和miR-26b通过与ST8SIA4的3′UTR结合，靶向调控ST8SIA4，使其表达水平下调。　　第五部分 miR-26a/26b靶向调控 ST8SIA4的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响　　目的：　　通过特异性上调及下调miR-26a/26b在乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7中的表达，观察过表达、干扰前后，miR-26a/26b对乳腺癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响；调控ST8SIA4的表达，分析miR-26a/26b对乳腺癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响。　　方法：　　将miR-26a/26b mimic和miR-26a/26b inhibitor分别转染至MDA-MB-231和MCF-7细胞后，特异性上调MDA-MB-231中的miR-26a/26b、下调MCF-7中的miR-26a/26b表达，采用CCK-8细胞增殖实验、划痕试验和transwell实验，检测过表达、干扰前后，乳腺癌细胞体外增殖能力和侵袭能力变化。　　结果：　　（1）与转染NC mimic相比，特异性上调MDA-MB-231中的miR-26a/26b后，免疫荧光结果显示，ST8SIA4表达明显减低（Figure15A）。CCK-8增殖实验结果显示，细胞增殖能力明显下降（Figure16）；划痕实验和transwell实验结果显示，细胞迁移、侵袭能力明显下降（Figure17A，B）。其次，ST8SIA4的过表达能够明显的逆转miR-26a/26b对细胞侵袭的抑制（Figure19）。　　(2)与转染NC inhibitor相比，特异性下调MCF-7中的miR-26a/26b后，免疫荧光结果显示，ST8SIA4表达明显增强（Figure21A，B）。CCK-8细胞增殖实验结果显示，其细胞增殖能力明显提高（Figure22）；划痕实验和transwell实验结果显示，细胞迁移、侵袭能力明显增强（Figure23A）。其次，ST8SIA4的敲除能够明显逆转miR-26a/26b inhibitor对细胞侵袭的促进作用（Figure25）。　　结论：　　（1）过表达miR-26a/26b能够抑制乳腺癌细胞的増殖、迁移及侵袭。　　（2）抑表达miR-26a/26b能够促进乳腺癌细胞的増殖、迁移及侵袭。　　（3）过表达ST8SIA4能够逆转miR-26a/26b对乳腺癌细胞侵袭的影响。　　（4）miR-26a/b通过靶向调控 ST8SIA4的表达影响乳腺癌细胞的体外增殖和侵袭能力。改变乳腺癌细胞膜蛋白唾液酸化状态，可以调控肿瘤细胞的增殖和侵袭，改善乳腺癌患者的预后。

目录

声明

前言

材料和方法

1.实验材料

2. 实验方法

第一部分 质谱分析乳腺癌组织和细胞株表面N-糖链的组成差异

结果

讨论

结论

第二部分 实时荧光定量PCR检测组织和细胞株唾液酸糖基转移酶 (ST) 基因mRNA的表达及ST8SIA4在组织和细胞株中蛋白的表达

结果

讨论

结论

第三部分 特异性下调MDA-MB-231细胞中的ST8SIA4的表达，观察其对乳腺癌细胞体外的增殖和侵袭能力、体内成瘤性的影响

结果

讨论

结论

结果

讨论

结论

第五部分 miR-26a/26b靶向调控 ST8SIA4的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响

结果

讨论

结论

讨论

结论

参考文献

综述:MicroRNAs与唾液酸化修饰的相互作用在肿瘤中的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢