去泛素化酶USP7抑制剂P5091对卵巢癌抑制作用的研究

摘要

卵巢癌是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一，由于卵巢癌早期诊断困难，缺乏有效的防治措施，卵巢癌死亡率居首位，其中上皮性卵巢癌占卵巢恶性肿瘤的85%～90%[1-3]。目前对于卵巢癌的治疗方案主要为有效的手术治疗以及铂类联合紫杉醇为主的化疗。但是现在有大量晚期卵巢癌患者面临铂类或者紫杉醇耐药的难题，导致治疗效果不佳，所以探索新的卵巢癌靶向治疗药物是尤为重要的。有相关实验研究去泛素化酶USP7在浆液性卵巢癌组织中高表达[4-5]。在去泛素化酶USP7抑制剂的药物研究方面，已经证实P5091有对抗肿瘤细胞增值活性的作用。P5091是一种选择性的，有效的去泛素化酶USP7抑制剂,有研究报道P5091能够抑制多发性骨髓瘤的生长并且能够延长小鼠的寿命[6]。目前P5091用于卵巢癌的相关研究国内外尚未见报道。　　首先，我们通过免疫组化的方法检测出上皮性卵巢癌组织标本相对于正常卵巢癌组织标本以及良性卵巢肿瘤组织标本中去泛素化酶USP7高表达。其次，通过相关实验我们发现去泛素化酶抑制剂P5091作用于卵巢癌细胞能够抑制细胞增值，诱导细胞死亡，对细胞起到抑制作用。最后，我们探究P5091对细胞抑制作用的相关机制。USP7能够成为将来卵巢癌诊治的新靶点，USP7抑制剂P5091能够成为卵巢癌诊疗的新药物。　　目的：　　1.探究去泛素化酶USP7在上皮性卵巢癌组织中高表达。　　2.探究去泛素化酶USP7抑制剂P5091作用于卵巢癌细胞能够抑制卵巢癌细胞增殖，诱导卵巢癌细胞死亡，对卵巢癌细胞起到抑制作用。　　3.探究去泛素化酶USP7抑制剂P5091对卵巢癌细胞抑制作用的相关机制。　　方法：　　1.通过免疫组化的方法对收集的临床标本进行检测，分析实验结果，判断去泛素化酶USP7是否在上皮性卵巢癌组织中高表达。　　2.选择两个卵巢癌细胞系，其中HeyA8为p53野生型细胞，OVCAR-8为p53突变型细胞。P5091设定为5?M、10?M、20?M、30?M、40?M、50?M六个浓度，通过MTT检测，观察药物对细胞是否有抑制作用。　　3.通过倒置显微镜以及Hoechst33342检测观察P5091对卵巢癌细胞的影响。　　4.通过流式细胞术细胞周期实验检测P5091作用于卵巢癌细胞是否发生周期阻滞。　　5.通过流式细胞术细胞凋亡实验以及Western blotting实验相关凋亡蛋白的表达，检测P5091作用于卵巢癌细胞是否发生细胞凋亡和坏死。　　6.通过Western blotting实验检测USP7、HDM2、p53蛋白的表达，探究P5091对卵巢癌细胞抑制作用与p53-HDM2通路的关系。　　结果:　　通过免疫组化实验，相对于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢组织，上皮性卵巢癌组织标本中去泛素化酶USP7高表达。　　实验选择两种卵巢癌细胞，其中HeyA8为p53野生型细胞，OVCAR-8为p53突变型细胞。　　通过MTT检测，发现P5091能够抑制卵巢癌细胞增殖。通过倒置显微镜观察到加药处理后细胞形态发生明显变化，Hoechst33342实验观察到加药处理后变亮变形细胞数增多,说明P5091诱导卵巢癌细胞死亡。　　通过流式细胞术细胞周期实验，经过P5091处理18h后卵巢癌细胞发生了周期阻滞，细胞阻滞可能是细胞死亡的原因之一。流式细胞术细胞凋亡实验检测以及Western blotting实验凋亡相关蛋白的检测结果说明P5091药物作用于卵巢癌细胞系引起细胞发生了凋亡和坏死。　　通过Western blotting实验对USP7、HMD2、p53蛋白的检测，说明P5091作用于HeyA8细胞早期，HDM2对p53的抑制起主要作用，P5091作用于HeyA8细胞后期，USP7对p53的稳定起主要作用，说明P5091作用于HeyA8细胞与p53-HDM2通路相关。P5091作用于OVCAR-8细胞可能与p53-HDM2通路相关性不大。　　结论：　　1.去泛素化酶USP7在上皮性卵巢癌组织中高表达。　　2.去泛素化酶USP7抑制剂P5091能够抑制卵巢癌细胞增殖，诱导卵巢癌细胞死亡，对卵巢癌细胞起到抑制作用，可能与细胞周期阻滞有关。　　3.去泛素化酶USP7抑制剂P5091能引起卵巢癌细胞凋亡和坏死。　　4.P5091对于卵巢癌p53野生型细胞HeyA8的抑制作用与p53-HDM2通路有关，P5091对于卵巢癌p53突变型细胞OVCAR-8的抑制作用可能与p53-HDM2通路相关性不大。

目录

声明

前言

材料和方法

1.材料

2.实验方法

实验结果

1.去泛素化酶USP7在上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中的表达结果

2.去泛素化酶USP7抑制剂P5091能够抑制卵巢癌细胞增殖，诱导卵巢癌细胞死亡，对卵巢癌细胞起到抑制作用

3.去泛素化酶USP7抑制剂P5091能够引起卵巢癌细胞发生凋亡和坏死

4.P5091 对于卵巢癌 p53 野生型细胞 HeyA8 的抑制作用与p53-HDM2 通路有关， P5091 对于卵巢癌 p53 突变型细胞OVCAR-8的抑制作用可能与p53-HDM2通路相关性不大

讨论

结论

参考文献

综述:泛素特异性蛋白酶USP7与肿瘤关系的研究进展

致谢