转座子介导的增强子捕获技术在斑马鱼上初步应用

摘要

转座子(Transposon，Tn)，存在于生物界的各种生物基因组中，是一段可以在基因组上自由移动并改变其位置的DNA序列。转座子天然具有基因转移特性，可作为基因载体用于基因组遗传修饰。Sleeping Beauty(SB)、PiggyBac(PB)和Tol2等三种转座子目前被广泛应用于脊椎动物转基因研究构建基因突变体库，研究基因表达调控机理及表达特性。本研究利用自行构建的SB、PB和To12介导的增强子捕获载体制备了增强子捕获斑马鱼，比较报告基因和捕获的增强子及内源基因时空表达模式，以期获得调控组织发育或细胞分化的特异性增强子。主要获得以下研究结果:　　1、根据不同荧光表型将SB、PB及To12介导的增强子捕获转基因斑马鱼F1代进行分类，选择具有典型表达模式的个体建立7个品系，分别为SK-1、SK-3、SK-6、SK-12、TK-1、TK-4及PK-0。将7个品系分别与野生型交配产生F2代，观察其胚胎早期不同发育阶段绿色荧光蛋白表达模式，结果表明7个品系荧光表型主要分为:脑、躯干、眼睛、心脏、下颌等。以F2代基因组为模板进行SP-PCR及测序结果表明，捕获载体分别插入整合在基因组不同位点分布在5个不同染色体;共捕获了7个不同的内源基因(slc9a8、ednraa、mettl22、wdr33、dlx1a、rps26和itgav)，其中4个插入位点位于内含子，1个位于外显子，2个分别位于基因上游20Kb和下游10bp处。　　2、利用内源基因反义RNA作为探针进行斑马鱼胚胎原位杂交，结果表明在24hpf和48hpf两个发育阶段，内源基因与报告基因绿色荧光蛋白表达模式大体一致。脑、眼及全身等荧光信号强的组织其杂交后着色也较深。　　综上所述，本研究表明，三种转座子介导的增强子捕获载体均能有效应用于增强子捕获。报告基因和内源基因可能在相同增强子调控下表达，绿色荧光信号基本可代表内源基因的时空表达特性。本研究可为增强子注解提供重要参考，为进一步研究增强子表达调控功能及基因活性奠定基础，对后基因组时代的研究具有重要的意义。

目录

论文说明

摘要

英文缩略词

第一篇 文献综述

1 转座子概述

1．1 转座子定义

1．2 转座子类型

1．3 转座子家族

2 SB转座子的研究进展

2．2 SB转座子的作用机制

2．3 SB转座子的应用

3 Tol2转座子的研究进展

3．2 Tol2转座子的应用

4 PB转座子的研究进展

4．2 PB转座子的应用

5 增强子捕获概述

5．1 增强子捕获的定义

5．2 增强子捕获载体与应用

第二篇 试验研究

前言

第一章 增强子捕获斑马鱼基因组注解

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 增强子捕获的内源基因表达模式验证

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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