斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用

摘要

本发明公开了一种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，涉及一种组织和器官特异性表达基因的增强子捕获技术领域，用于荧光标记斑马鱼胚胎发育过程中的神经细胞。斑马鱼神经组织特异性增强子，其序列为SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列。其应用是：①研制神经组织特异表达荧光的转基因鱼，可用于神经器官再生过程研究；②用于驱动任意目的基因在神经组织特异表达，为研究者研究神经系统发育及相关疾病治疗提供有力工具。本发明可用于斑马鱼眼睛发育及损伤再生过程的研究；有助于研究特定基因在神经系统发育及调控方面的作用，为相关疾病治疗提供新材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织和器官特异性表达基因的增强子捕获技术领域，尤其涉 及一种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，用于荧光标记斑马鱼胚胎 发育过程中的神经细胞。

背景技术

增强子捕获技术是一种研究基因组中存在的增强子序列的正向遗传学方法 之一，它用于发现已知及未知的组织特异表达的增强子元件。过去几十年来，国 内外采用增强子捕获技术，获得了多种组织和器官特异表达荧光的斑马鱼品系， 而对相关基因位点插入信息获得较少，很多组织器官如神经系统、肝脏、胰腺和 肾脏等特异表达的增强子和启动子尚未被克隆。神经系统发育是发育生物学研究 的热点之一，目前已获得一些荧光标记神经系统的转基因斑马鱼品系，它们被广 泛用于神经突触及神经递质传递方面的研究。神经系统发育及信号调控的精密性 和复杂性，需要更多标记不同神经细胞的转基因品系的出现。

经检索，目前尚未发现相同于本发明的对斑马鱼神经组织特异性增强子的克 隆。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有研究中神经组织特异性增强子较少的问题，提 供一种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，即通过增强子捕获载体建 立神经系统特异表达荧光的转基因斑马鱼，克隆获得了一种在神经组织特异表达 的增强子序列。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一、斑马鱼神经组织特异性增强子

该增强子位于斑马鱼基因组第7号染色体90kb的区域(Zv9，染色体7： 15189000-15279000),特异表达在斑马鱼前脑、中脑、后脑、脊髓和眼睛神经组 织中；其序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。

二、斑马鱼神经组织特异性增强子的克隆方法

①所采用的增强子捕获载体

具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，长4881bp，由mMT1弱启动子驱动绿 色荧光蛋白报告基因、剪接受体SA和Tol2转座子三部分组成；

②神经组织特异性表达绿色荧光蛋白的转基因鱼的获得

通过斑马鱼胚胎显微注射、绿色荧光蛋白荧光筛选以及原位杂交与切片分 析，获得神经组织特异表达荧光的斑马鱼；

具体地，采用Tol2转座子系统，进行斑马鱼基因转移。采用显微注射的方 式将转基因载体导入斑马鱼单细胞期胚胎，通过绿色荧光蛋白表达观察，获得 F0代转基因鱼个体。将F0代性性成熟鱼与野生型鱼进行测交获得F1代胚胎， 绿色荧光蛋白荧光筛选神经组织异表达荧光的F1代阳性鱼。由于F1代多数来源 于嵌合体胚胎，具有不同的插入位点等遗传背景，因此，将F1代阳性鱼与野生 型鱼进行测交获得同一遗传背景的F2代。将F2代阳性鱼自交得到F3代，即可 获得稳定的神经组织特异表达绿色荧光蛋白的斑马鱼品系，我们命名为pTME12。 激光共聚焦显微镜观察、整体原位杂交与冰冻切片分析，进一步证实了绿色荧光 蛋白特异性表达在斑马鱼神经组织。

③增强子的克隆

通过染色体步移与基因组序列电子克隆，获得神经组织特异性增强子；

采用染色体步移方法：我们发现增强子捕获载体正向插入到rhcga基因编码 区下游46kb的非编码区，并以反方向位于kif7基因编码区的下游45kb处。我 们将斑马鱼，虎河豚，青鱂鱼中位于rhcga和kif7基因之间的基因组序列进行 比较基因组学分析，利用mVISTA软件，我们在斑马鱼基因组90kb的染色体区域 (Zv9，染色体7:15189000-15279000)获得4个高度保守(序列长度大于100bp 并具有>75％的一致性)的非编码元件。随后，我们将四个CNE序列分别克隆到 pTME载体中mMTI启动子的上游，进行斑马鱼胚胎显微注射、绿色荧光蛋白表达 分析，获得一个潜在的驱动绿色荧光蛋白在神经组织特异表达的增强子。

三、斑马鱼神经组织特异性增强子的应用

①研制神经组织特异表达荧光的转基因鱼，可用于神经器官再生过程研究；

②用于驱动任意目的基因在神经组织特异表达，为研究者研究神经系统发育 及相关疾病治疗提供有力工具。

与以往的增强子捕获研究相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①获得一种神经组织特异表达的转基因鱼，并发现该荧光特异标记斑马鱼眼 睛Müllerglia细胞，可用于斑马鱼眼睛发育及损伤再生过程的研究。

②首次获得表达在神经组织的增强子基因序列，该序列可用于驱动包括报告 基因在内的任意目的序列在神经系统中特异表达，从而有助于研究特定基因在神 经系统发育及调控方面的作用，为相关疾病治疗提供新材料。

附图说明

图1是神经组织特异绿色荧光蛋白表达模式分析图，

激光共聚焦显微观察及整体原位杂交数据显示绿色荧光蛋白表达在端脑和嗅 板(A、D)，前脑、中脑、后脑、脊髓以及眼睛部位等组织器官中(B、C、E、F、 G、H、I、J)。

图2是荧光表达细胞类型检测图，

对pTME12品系鱼48hpf至72hpf胚胎切片分析结果，A、B显示绿色荧光蛋 白表达在斑马鱼神经系统中类似放射状胶质细胞(RadialGlia)，C、D显示EGFP 标记眼睛视网膜中的Müllerglia细胞类型。

图3是基因组插入位点分析图，

A—增强子捕获载体基因组插入位点示意图；

B—右侧完整性分析，所用引物位置如A所示；

C—左侧完整性分析，所用引物位置如A所示。

图4是增强子序列分析图，

通过电子预测，获得4个高度保守的非编码元件，分别命名为CNE1、CNE2、 CNE3和CNE4。

图5是增强子活性分析图，

A—增强子活性测试载体示意图；

B—增强子活性分析：a、b是pTME12转基因斑马鱼品系中观察到的EGFP 表达模式；c、d是CNE2增强子驱动报告基因的表达模式，与pTME12转基因斑 马鱼品系一致，即在中脑、后脑和脊索特异表达；e、f是整体原位杂交的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明详细说明：

实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实 验指南(第二版，1992年，科学出版社)中所述实验方法。

实施例1、增强子捕获载体的构建：

①设计引物，从pmMREd12mt1LUC3质粒中扩增mMT1最小启动子元件，所需 引物序列：

上游引物：5’-ATATTCGTACGACTCGTCCAACGACTATAA-3’(NO.3)；

下游引物：5’-CGGGGTACCGGTGAAGCTGGAGCTACG-3’(NO.4)。

②以pmMREd12mt1LUC3质粒为模板，用上述引物，扩增出105bp的片段，PCR 循环条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min， PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。

③上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BsiWI及KpnI进行酶切， 与经过相同酶切的pEF1ɑ-EGFP载体大片段连接，转化大肠杆菌Top10’感受态 细胞，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落，经过酶切鉴定，得到 pmMT1-EGFP-BGHPolyA中间载体；然后采用BsiWI和BbuI分别双酶切 pmMT1-EGFP-BGHPolyA和En-Trap载体，并对酶切产物进行连接，得到 pmMT1-enhancertrap载体。

④设计引物，从pmMT1-enhancertrap质粒上扩增增强子捕获核心元件，所 用引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCTTCAGCCGATGATGAAATTG-3’(NO.5)；

下游引物：5’-CATGCTTAGCCTGCCCCAGCTGGTTCTTTCCG-3’(NO.6)。

⑤以pmMT1-enhancertrap质粒为模板，用上述引物，扩增出1204bp的长 片段，PCR循环条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min30s，30 个循环；72℃10min；PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。

⑥上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶EcoRI及Bpu1102I进行 双酶切，与经过相同酶切的pminiTol2-genebreaking载体大片段连接，转化大 肠杆菌Top10’感受态细胞，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落， 经过酶切鉴定，得到增强子捕获载体pminiTol2/SA-Exon-mMT1-EGFP-BGHPolyA， 我们简写为pTME。

实施例2、斑马鱼饲养与转基因显微注射

①斑马鱼饲养：斑马鱼(Daniorerio)，AB品系，饲养条件28℃，12h光照 /12h黑夜。

②合成Tol2转座酶cappedmRNA

A、线性化：用BamHI酶切线性化转录所用载体；

B、采用BioFluxDNA凝胶回收试剂盒回收线性化模板，DEPC水溶解线性化 模板；

C、转录：采用成熟mRNA合成试剂盒里的T7转录酶(Ambion,FosterCity,CA) 进行转录，转录体系如下所示：

将上述组分混匀后，37℃，转录2h；

D、取1μL电泳检测后，加入0.5μL2U/μLDnaseI，37℃15min；

E、加入57.5μLNucleare-freewater和7.5μLNH4AC终止反应；

F、等体积苯酚氯仿/氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，-20℃15min。

G、12000g(转速)4℃离心15min，70％乙醇洗3次,室温放置5min。

H、溶于10μLDEPC水。

I、取0.5μL电泳观察合成RNA产物的完整性，并用分光光度计检测浓度。

③转基因显微注射

A、斑马鱼胚胎的准备：实验前一天晚上将成熟的雌雄斑马鱼按1:2的比例 放于同一容器中，中间用隔板隔开，第二天早上将隔板拿开，15min后收集受精 卵；

B、整个操作过程保证无核酸酶污染，将50ng/μL的Tol2转座酶cappedmRNA 和25ng/μL的转基因载体pTME混匀，注射到单细胞期的斑马鱼胚胎，注射位点 为胚盘和卵黄的交界处,注射体积为2nL左右；

C、将注射好的胚胎放入盛有养鱼水的平皿中，放置于28℃培养箱中。

实施例3、转基因斑马鱼的阳性筛选

将F0代性成熟的斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，采用CarlZeissSteReo LumarV12体视荧光显微镜，对获得的F1代进行绿色荧光观察；绿色荧光蛋白 的激发波长为488nm，发射波长为507nm，采用蔡司荧光倒置显微镜，对12hpf， 24hpf，48hpf，72hpf，4day，5day时期的F1代胚胎进行荧光观察，获得在神 经系统中有特异绿色荧光蛋白表达的斑马鱼胚胎；将荧光胚胎挑出，养至斑马鱼 成鱼，并进一步和野生型斑马鱼杂交，获得足够的转基因斑马鱼杂合子F2；杂 合子自交即可获得荧光标记的纯合子F3。

激光共聚焦显微观察及整体原位杂交显示绿色荧光蛋白在24hpf、42hpf、 48hpf、72hpf不同发育时期的中枢神经系统表达模式(图1A-J)；进一步冰冻切 片分析，我们发现该品系鱼中绿色荧光蛋白标记了斑马鱼神经系统中类似放射状 胶质细胞(RadialGlia)(图2A,B)和眼睛视网膜中的Müllerglia细胞类型(图 2C，D)。

实施例4、增强子序列克隆分析

①精提基因组DNA

A、配制高分子量抽提裂解液：10mMTris-cl，100mMEDTA，0.5％SDS (Westerfield.2000)；

B、使用前，在裂解液里加入蛋白酶K，使其终浓度为200ng/μL；每个1.5mL EP管里分装200μL裂解液，用手术剪剪取斑马鱼尾鳍；56℃裂解6h，其间每隔 两个小时摇动EP管，可以加快组织裂解；随着组织块的裂解，裂解液变得透明， 说明裂解完全。

C、加入等体积的Tris-饱和酚，混匀静置5min，然后5000g，离心10min， 取上清，重复操作一次；

D、取上清转移到一个新管子里面，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25： 24：1)，混匀静置5min，然后5000g，离心10min；

E、然后将上清转移到新管子里面，用2.5倍体积的预冷的无水乙醇沉淀基 因组DNA，加入适量的氯化钠，使其终浓度为0.1M；

F、可以看到絮状沉淀形成，将此絮状沉淀用圆口枪头吸出，转移到75％的 无水乙醇中，洗涤5min；

G、加TEbuffer溶解沉淀DNA；

H、采用超微量分光光度计进行DNA浓度测定。

②染色体步移法获得插入位点序列信息

为检测pTME12品系中增强子捕获元件在基因组中的插入位点，我们对来源 于F2代胚胎的基因组进行染色体步移分析，发现增强子捕获载体正向插入到 rhcga基因编码区下游46kb的非编码区，并以反方向位于kif7基因编码区的下 游，如图3A所示。

具体的实验操作过程如下：

A、取F2代转基因斑马鱼胚胎精提基因组DNA；

B、根据Tol2转座子的左右臂序列ITR-L和ITR-R，分别设计三个同向的引 物，引物序列分别为L1，L2，L3和R1，R2，R3，引物设计的原理参照Takara 染色体步移试剂盒，所用引物具体序列如下：

AD5：5’-STAGNATSGNGTNCAA-3’(NO.7)(兼并引物)；

R1：5’-GTACAATTTTAATGGAGTACTTTTTTACTTTTACTCAAG-3’(NO.8)；

R2：5’-CCAGATACTTTTACTTTTAATTGAGTAAAATTTTCC-3’(NO.9)；

R3：5’-CACTTGAGTAAAATTTTTGAGTACTTTTTACACC-3’(NO.10)；

L1：5’-GGTTTGGTAATAGCAAGGGAAAATAGAATG-3’(NO.11)；

L2：5’-GATTTTTAATTGTACTCAAGTAAAGTAAAAATCCCC-3’(NO.12)；

L3：5’-CAGTAATCAAGTAAAATTACTCAAGTACTTTACACC-3’(NO.13)；

C、进行第一轮PCR反应，反应体系如下(以AD5和Tol2转座子右臂引物为 例说明)：

系统每个反应成分的量

反应程序：1个循环：94℃，1min；

1个循环：98℃，1min；

5个循环：94℃，30s；63℃，1min；72℃，2min；

1个循环：94℃，30s；25℃，3min；72℃，2min；

15个大循环：94℃，30s；63℃，1min；72℃，2min；

94℃，30s；63℃，1min；72℃，2min；

94℃，30s；44℃，1min；72℃，2min；

1个循环：70℃，10min；

D、取第一轮PCR产物0.5μL作为模板进行第二轮PCR反应，反应体系如下：

15个大循环：94℃，30s；63℃，1min；72℃，2min；

94℃，30s；63℃，1min；72℃，2min；

94℃，30s；44℃，1min；72℃，2min；

1个循环：70℃，10min；

E、取第二轮PCR产物0.5μL作为模板进行第三轮PCR反应，反应体系同第 二轮PCR体系，反应程序与第二轮PCR程序相同。

F、取第一、二轮PCR产物15μL以及第三轮PCR产物全部进行琼脂糖凝胶 电泳分析，取第三轮比第二轮小100bp左右的目的条带进行测序，将测序结果输 入ENSEMBL网站中的BLAT查找基因组中的匹配序列；

③插入位点PCR验证

为进一步确定捕获元件的整合位点，我们设计位于捕获元件和插入位点附近 基因组序列的引物进行PCR。如图3中的B所示，用引物RF/R3扩增得到283bp 的DNA条带，用RF/ER扩增获得711bp的DNA条带；对这两个条带的测序结果显 示捕获元件的左端精确整合到基因组；同时，我们用引物对L2/LR扩增获得484bp 的PCR产物，用引物对L1/LR扩增获得620bp的DNA片段(图3中的C)。测序 序列数据表明捕获元件的右端也以我们预期的方式插入到基因组中。

所用引物序列如下：

RF：5’-ATGTGTCTTCATCTGAAAAGCGTTC-3’(NO.14)；

LR：5’-GTACATCCTTGCTCAGAATCTCCCTC-3’(NO.15)；

R3：5’-CACTTGAGTAAAATTTTTGAGTACTTTTTACACC-3’(NO.10)；

ER:5’-CACATACCGGCTACGTTGCTAAC-3’(NO.16)；

L1：5’-GGTTTGGTAATAGCAAGGGAAAATAGAATG-3’(NO.11)；

L2：5’-GATTTTTAATTGTACTCAAGTAAAGTAAAAATCCCC-3’(NO.12)；

④增强子序列克隆

针对插入位点序列信息，从NCBI下载斑马鱼基因组位于插入位点上游及下 游共99kb的序列，同时下载青鱂，虎河豚对应位置的序列；将以上三组序列上 传至mVISTA，进行潜在增强子序列的预测。

我们将斑马鱼、虎河豚和青鱂鱼中位于rhcga和kif7基因之间的基因组序 列进行比较基因组学分析，利用mVISTA软件，我们在斑马鱼基因组90kb的染色 体区域(Zv9，染色体7：15189000-15279000)获得4个高度保守(序列长度大 于100bp并具有>75％的一致性)的非编码元件，分别命名为CNE1，CNE2，CNE3 和CNE4(图4)。

在预测非编码序列两端设计引物，以斑马鱼基因组为模板，进行PCR扩增， 所用引物序列如下：

CNE1-F：5’-CAATCTAGAGCCCACAGATCTGCACTTG-3’(NO.17)；

CNE1-R：5’-GGCTCGAGATTATACCCAAGCAACAACAGG-3’(NO.18)；

CNE2-F：5’-CAATCTAGACTGCGTCAAACTATAGAAAACTGG-3’(NO.19)；

CNE2-R：5’-GGCTCGAGAATCATTTATATCTTCCAAACCAGTAAG-3’(NO.20)；

CNE3-F：5’-CAATCTAGAATCCCAATCCCAGGCTTTTC-3’(NO.21)；

CNE3-R：5’-GGCTCGAGTCATCTGTGGTCATAGCAGC-3’(NO.22)；

CNE4-F：5’-CAATCTAGAGTGAGAGGCGACAGCGTGAG-3’(NO.23)；

CNE4-R：5’-GGCTCGAGGGTACAGTGTCTCTCCGAGGGCAG-3’(NO.24)。

⑤增强子活性验证

我们将四个CNE序列分别克隆到pTME载体中mMTI启动子的上游构成四个质 粒pTME-CNE1，pTME-CNE2,pTME-CNE3和pTME-CNE4(图5中的A)；这四个质粒 被分别注射到斑马鱼单胞期的受精卵，我们发现9％(58/650)注射了pTME-CNE2 质粒的胚胎发育至48h时出现中脑，后脑和脊髓特异的EGFP表达(图5中的B-c 和图5中的B-d，EGFP)(图5中的B-e和B-f，WISH)，这种胚胎在48h的EGFP 表达区域与我们在pTME12转基因斑马鱼品系中观察到的EGFP表达区域基本一致 (图5中的B-a和B-b)；注射质粒pTME-CNE1,pTME-CNE3和pTME-CNE4的胚胎 显示泛表达的GFP信号，可能暗示这些序列具有弱启动子活性，但缺少增强子活 性；这些结果表明CNE2是一个潜在的调控mMTI启动子驱动EGFP神经组织特异 表达的增强子元件，具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。

序列表

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用

<160>24

<210>1

<211>4881

<212>DNA

<400>

GGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTT TATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTA TGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACGCGT TGGGAGCTCTCCCATATGGTCGAGCAGAGGTGTAAAAAGTACTCAAAAATTTTACTCAAGTGAAAG TACAAGTACTTAGGGAAAATTTTACTCAATTAAAAGTAAAAGTATCTGGCTAGAATCTTACTTGAG TAAAAGTAAAAAAGTACTCCATTAAAATTGTACTTGAGTATTAAGGAAGTAAAAGTAAAAGCAAGA AAGAAAACTAGAGATTCTTGTTTAAGCTCATGGTAGGGATAACAGGGTAATATAACTTCGTATAGC ATACATTATACGAAGTTATCGTTACCACCCACTAGCGGTCAGACTGCAGATTGCAGCACGAAACAG GAAGCTGACTCCACATGGTCACATGCTCACTGAAGTGTTGACTTCCCTGACAGCTGTGCACTTTCT AAACCGGTTTTCTCATTCATTTACAGTTCAGCCGGAATTCTTCAGCCGATGATGAAATTGCCGCAC TGGTTGTTAGCAACGTAGCCGGTATGTGAATGATGAATTAGTGACGTACGACTCGTCCAACGACTA TAAAGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCACCACGACTTCAACGTCCTGAGTACCTTCTCCTCACT TACTCCGTAGCTCCAGCTTCACCGGTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC ACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCC GGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAG CTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC CCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGC ACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG GTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAG AACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCC CTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGG ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACT GTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGT GCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCAT TCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCAT GCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCAGGCTAAGCATG CTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTACCCTGTTATCCCTACAAATTAAACTGG GCATCAGCGCAATTCAATTGGTTTGGTAATAGCAAGGGAAAATAGAATGAAGTGATCTCCAAAAAA TAAGTACTTTTTGACTGTAAATAAAATTGTAAGGAGTAAAAAGTACTTTTTTTTCTAAAAAAATGT AATTAAGTAAAAGTAAAAGTATTGATTTTTAATTGTACTCAAGTAAAGTAAAAATCCCCAAAAATA ATACTTAAGTACAGTAATCAAGTAAAATTACTCAAGTACTTTACACCTCTGGGCCCAATTCGCCCT ATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG TTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCC GCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGC ATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCC CGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA TCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTA GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTC CACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAA ATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACG CATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTAT TTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCT TCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT TGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTT TCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATC CCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGA GTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGC CATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAA ACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGA TAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGG AGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGAT AGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGA TTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAA AATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTC TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGT GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCA GATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCT TACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTC GTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATG AGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAAC AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCG CCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGC GTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAG CCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCC TCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC；

<210>2

<211>247

<212>DNA

<400>

CTGCGTCAAACTATAGAAAAACTGGACTCAAGCAGCCGGGGGGGTTTAAGATATATTAAATTACCATGA TTGGGAATTTAGGCATGGTTCAAGCCTGTTGAAGAGGCTGGGGTGTCTGAAAGTGGTGCTATTCATCTC GGGAAAAGAGGGTCAGAAGGTCGGGGAAGTTCACAGGACCTGTTCCTATTCTTATGCTAACTTACAATA CAGAGTCTAATGCTTACTGGTTTGGAAGATATAAATGATT；

<210>3

<211>30

<212>DNA

<400>

ATATTCGTACGACTCGTCCAACGACTATAA；

<210>4

<211>27

<212>DNA

<400>

CGGGGTACCGGTGAAGCTGGAGCTACG；

<210>5

<211>29

<212>DNA

<400>

CCGGAATTCTTCAGCCGATGATGAAATTG；

<210>6

<211>32

<212>DNA

<400>

CATGCTTAGCCTGCCCCAGCTGGTTCTTTCCG；

<210>7

<211>16

<212>DNA

<400>

STAGNATSGNGTNCAA；

<210>8

<211>39

<212>DNA

<400>

GTACAATTTTAATGGAGTACTTTTTTACTTTTACTCAAG；

<210>9

<211>36

<212>DNA

<400>

CCAGATACTTTTACTTTTAATTGAGTAAAATTTTCC；

<210>10

<211>34

<212>DNA

<400>

CACTTGAGTAAAATTTTTGAGTACTTTTTACACC；

<210>11

<211>30

<212>DNA

<400>

GGTTTGGTAATAGCAAGGGAAAATAGAATG；

<210>12

<211>36

<212>DNA

<400>

GATTTTTAATTGTACTCAAGTAAAGTAAAAATCCCC；

<210>13

<211>36

<212>DNA

<400>

CAGTAATCAAGTAAAATTACTCAAGTACTTTACACC；

<210>14

<211>25

<212>DNA

<400>

ATGTGTCTTCATCTGAAAAGCGTTC；

<210>15

<211>26

<212>DNA

<400>

GTACATCCTTGCTCAGAATCTCCCTC；

<210>16

<211>23

<212>DNA

<400>

CACATACCGGCTACGTTGCTAAC；

<210>17

<211>28

<212>DNA

<400>

CAATCTAGAGCCCACAGATCTGCACTTG；

<210>18

<211>30

<212>DNA

<400>

GGCTCGAGATTATACCCAAGCAACAACAGG；

<210>19

<211>33

<212>DNA

<400>

CAATCTAGACTGCGTCAAACTATAGAAAACTGG；

<210>20

<211>36

<212>DNA

<400>

GGCTCGAGAATCATTTATATCTTCCAAACCAGTAAG；

<210>21

<211>29

<212>DNA

<400>

CAATCTAGAATCCCAATCCCAGGCTTTTC；

<210>22

<211>28

<212>DNA

<400>

GGCTCGAGTCATCTGTGGTCATAGCAGC；

<210>23

<211>29

<212>DNA

<400>

CAATCTAGAGTGAGAGGCGACAGCGTGAG；

<210>24

<211>32

<212>DNA

<400>

GGCTCGAGGGTACAGTGTCTCTCCGAGGGCAG。