重组复制缺陷型腺病毒介导的人IL-24/MDA-7基因治疗胰腺癌的体内外实验研究

摘要

目的： 1．构建携带IL—24基因片段的重组复制缺陷型腺病毒Ad—IL—24，为探讨治疗胰腺癌的方法提供实验基础。 2．观察重组腺病毒介导的IL—24基因对人胰腺癌细胞patu8988生长的抑制作用，探讨IL—24抑制胰腺肿瘤生长的机理。 3．研究重组腺病毒介导的IL—24基因对小鼠髓系树突状细胞成熟活化的影响，探讨IL—24基因在肿瘤免疫治疗中的作用。 4．观察重组腺病毒介导的IL—24基因对裸鼠体内胰腺肿瘤生长的抑制作用，探讨IL—24对胰腺癌的治疗潜力。 方法：从Genbank中查得IL—24基因cDNA全长序列，选择5’端转录起始位点附近长621bp的基因序列为目的基因片段，设计特异性克隆引物。从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取总RNA，以总RNA为模板用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT—PCR）扩增IL—24基因片段。将经基因测序证实为正确的基因片段反向克隆到重组腺病毒载体AdEasy系统中的穿梭质粒pAdTrack—CMV的多克隆位点（multiple cloning site，MCS），构建携带IL—24基因片段的重组穿梭质粒pAdTrack—CMV—IL—24；再将pAdTrack—CMV—IL—24与重组腺病毒载体AdEasy系统中的骨架质粒pAdEasy—1在大肠杆菌DH5a内进行同源重组，经293细胞包装生成携带IL—24基因片段的重组腺病毒Ad—IL—24，同时构建空病毒Ad—GFP。通过在荧光显微镜下观察发绿色荧光数检测绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的表达，测定Ad—IL—24和Ad—GFP的滴度。用感染复数（multiplicities of infection，MOI）为100的Ad—IL—24感染人胰腺癌细胞株patu8988，用Western blot、ELISA检测细胞培养液中IL—24的蛋白表达；用MTT法、流式细胞术（FCM）分别检测Ad—IL—24对人胰腺癌细胞株patu8988生长情况的影响。采用小鼠髓系树突状细胞（BMDCs）开展研究，从小鼠骨髓中获取和培养未成熟树突状细胞（dendritic cells，DC），通过FCM、ELISA法检测DC经IL—24转染后表型和功能状态的变化，研究IL—24促进DC成熟活化的作用。裸鼠成瘤实验，观察人胰腺癌patu8988细胞的成瘤情况及IL—24对裸鼠体内胰腺肿瘤的治疗作用；通过免疫组化检测肿瘤组织中微血管密度MVD、VEGF、MMP—2的表达。 结果： 1．成功的从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取并扩增出621bp的IL—24基因片段，经DNA测序证实该基因片段序列与Genbank中IL—24基因cDNA序列5’端转录起始位点附近621bp的基因序列完全一致。 2．成功地构建出携带IL—24基因片段的重组腺病毒Ad—IL—24，病毒滴度>5×1010pfu/ml。 3．Ad—IL—24感染的patu8988细胞增殖能力降低，凋亡率明显升高。 4．IL—24刺激BMDCs48h后，细胞表现出成熟DCs的表型和功能特征，即共刺激分子CD40，CD80，CD86上调表达；并能有效拮抗负性调控因子IL—10下调DCs上CD40、CD80、CD86表达的作用，细胞培养液中IL—12、TNF—α的表达水平升高。 5．瘤内注射Ad—IL—24后胰腺肿瘤瘤体生长减慢，肿瘤内微血管密度MVD、VEGF、MMP—2较对照组明显减少，荷瘤裸鼠的生存期明显延长。 结论： 1．重组腺病毒介导的IL—24基因可明显抑制胰腺癌细胞的生长、促进胰腺癌细胞凋亡。 2．重组腺病毒介导的IL—24基因可促进树突状细胞的活化及功能成熟。 3．重组腺病毒介导的IL—24基因能抑制胰腺肿瘤血管生成，延长荷瘤裸鼠的生存期。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分IL-24基因的克隆及重组复制缺陷型腺病毒Ad-IL-24的构建和制备

材料与方法

结果

讨论

第二部分重组腺病毒介导的IL-24基因对胰腺癌细胞生长抑制作用的研究

材料与方法

结果

讨论

第三部分重组腺病毒介导的IL-24基因对树突状细胞成熟活化作用的研究

材料与方法

结果

讨论

第四部分重组腺病毒介导的IL-24基因治疗裸鼠皮下和原位胰腺癌的研究

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述：IL-24/MDA-7治疗肿瘤的研究进展

附 图

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