IUGR仔猪肠道黏膜免疫特性及丁酸衍生物对其调节作用研究

摘要

子宫内发育迟缓在人和猪上都很常见，全球每年出生的婴儿中约有1300万为IUGR，在中国，平均每一窝仔猪出生就有1-3头为IUGR仔猪，发病率约为15％-20％。IUGR会导致新生仔猪或新生胎儿较高的发病率和死亡率，甚至最终导致其长期的发育受损。IUGR给养猪生产和人类健康都带来了很大影响。如何从营养学的角度对母猪和IUGR仔猪进行调控，已经引进广泛关注。IUGR给养猪生产带来经济损失的主要原因有两个:1、IUGR新生仔猪较高的发病率和死亡率;2、存活下来的IUGR仔猪也会出现生长性能下降、饲料利用率下降和瘦肉率下降等情况。为了更好地制定IUGR仔猪的日粮，减少IUGR带来的损失，了解IUGR仔猪的生理及其作用机理具有很重要的意义。研究IUGR仔猪及其营养调控，不仅可以解决养猪生产中的IUGR问题，而且可以作为一种很好的医学模型。本试验以IUGR仔猪为研究对象，研究了IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫特性并探讨其分子作用机制;研究了三丁酸甘油酯对哺乳期IUGR仔猪生长和肠道黏膜免疫的调节作用;并比较研究了丁酸钠和三丁酸甘油酯对IUGR断奶仔猪生长和肠道黏膜免疫的调节作用。　　1.IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫特性　　试验一选取NBW和IUGR新生仔猪各6头，所有仔猪不喂食初乳，在出生后2-4小时内屠宰取样。测定体重、免疫器官重、小肠重量和长度、肠道形态、肠道上皮免疫细胞数量、肠道黏膜中细胞因子和免疫球蛋白含量、肠道黏膜中细胞因子的基因表达。结果表明，(1) IUGR组仔猪的胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结和肠道的绝对重量降低（P＜0.01），肠道绝对长度减小(P＜0.05)。IUGR新生仔猪的胸腺、脾脏和肠腺膜淋巴结的相对重量以及单位长度肠道重量显著低于（P＜0.01）NBW仔猪。但IUGR仔猪的相对小肠长度增加（P＜0.01）。(2)IUGR新生仔猪小肠肠道绒毛更易受损、更短、长短不一，而NBW仔猪小肠肠道绒毛多完整且整齐。IUGR新生仔猪小肠微绒毛比NBW仔猪的更短且更少。此外，在一些IUGR仔猪的肠道中还观察到自噬体和线粒体肿胀，而这些现象在NBW仔猪肠道中未找见。(3)IUGR新生仔猪小肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度的比值和绒毛表面积降低（P＜0.01），隐窝深度增加（P＜0.05）。IUGR仔猪回肠绒毛高度降低(P＜0.05)，空肠和回肠绒毛表面积减小(P＜0.05)，回肠绒毛隐窝深度（P＜0.01）和绒毛高度与隐窝深度的比值（P＜0.01）增加。(4) IUGR仔猪空肠（P＜0.05）和回肠（P＜0.01）上皮中杯状细胞数量显著降低。IUGR新生仔猪回肠上皮内淋巴细胞数量显著低于(P＜0.05)NBW仔猪。(5)IUGR新生仔猪小肠黏膜IFN-γ（P＜0.05）含量显著低于NBW组。IUGR新生仔猪回肠TNF-α的分泌量显著低于（P＜0.01）NBW仔猪。(6)IUGR新生仔猪空肠IFN-γ基因表达量低于(P＜0.05)NBW组。IUGR新生仔猪回肠黏膜内的IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.01)、IL10（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.01）的基因表达量都显著低于NBW组。总之，IUGR新生仔猪小肠黏膜免疫受损，其肠道和肠系膜淋巴结发育不良，肠黏膜机械屏障受损，肠黏膜上皮内的免疫细胞数量减少（包括杯状细胞和淋巴细胞），肠道黏膜分泌细胞因子的能力下降，并且回肠是主要的损伤部位。　　2.IUGR新生仔猪肠道CD4+和CD8+T淋巴细胞数量和分布　　试验设计同试验一。测定NBW和IUGR新生仔猪血清中中免疫球蛋白和细胞因子水平，血液和脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞百分数，胸腺、肠系膜淋巴结、空肠和回肠中CD4和CD8蛋白及基因表达，回肠黏膜中CD4和CD8蛋白的分布，空肠和回肠中MHC-Ⅱ基因表达及回肠中MHC-Ⅱ蛋白分布。结果表明，与NBW新生仔猪相比，(1) IUGR新生仔猪血清中IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.05)、IL4（P=0.085）、IL10(P＜0.05)和TNF-α（P=0.096）的含量降低或有降低的趋势。(2)IUGR新生仔猪血液和脾脏中CD8+T淋巴细胞百分数显著升高（P＜0.05），CD4+T和CD8+T淋巴细胞的比值降低（P＜0.05）。(3)新生仔猪CD4在胸腺中含量最高、肠系膜淋巴结中稍低、在肠道组织中更低(P＜0.05)。IUGR仔猪胸腺中CD8蛋白的表达量高于（P＜0.05）NBW仔猪，但肠系膜淋巴结中CD8蛋白的表达量低于（P＜0.05）NBW仔猪。(4) IUGR新生仔猪胸腺中的CD4基因表达量显著高于（P＜0.05）NBW仔猪。IUGR新生仔猪空肠和回肠的CD4和CD8基因的表达量都显著低于（P＜0.01）NBW。(5) CD4蛋白主要在NBW和IUGR新生仔猪回肠黏膜的绒毛固有层表达，CD8在回肠绒毛的上皮细胞和固有层中均有表达。CD4主要在细胞核内表达，而CD8在细胞核和细胞质中均有表达。(6) IUGR新生仔猪空肠和回肠中MHC-Ⅱ基因的表达量都显著低于(P＜0.01)NBW新生仔猪。MHC-Ⅱ在NBW仔猪回肠绒毛的固有层大片地表达，但在IUGR的绒毛固有层只是点状少量表达。总之，IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫受损与其体内CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群数量和分布不平衡、肠道抗原递呈功能减弱有关。　　3.IUGR新生仔猪肠道miRNA和Notch2/Jagged1信号通路关键因子的表述　　试验设计同试验一。测定NBW和IUGR新生仔猪胸腺、肠系膜淋巴结、空肠和回肠中Notch信号通路中关键基因的表达，空肠和回肠Notch信号通路和TLR信号通路关键基因的表达，小肠miRNA的表达，回肠miRNA的表达，回肠Jagged1蛋白的表达，猪的Jagged1基因与miRNA靶向作用的PITA评分。结果表明，与NBW组相比，(1) IUGR组胸腺Delta1基因表达量下降（P＜0.05），空肠中Delta1和Hes1基因基因、空肠和回肠中Jagged1基因表达量升高(P＜0.05)。(2)IUGR仔猪肠道内21种miRNA上调，22种miRNA下调。qRT-PCR验证结果与芯片结果基本一致。IUGR新生仔猪肠道中miR-19a-3p（P＜0.01）、miR-17-5p（P＜0.05）、miR-199a-5p（P=0.051）、miR-15a(P=0.076)、miR-19a（P＜0.01）和ssc-miR-19b(P＜0.01)都上调或有上调趋势;而miR320(P＜0.01)、miR-181b(P＜0.05)、ssc-miR-151-3p(P=0.050)、ssc-miR-128（P=0.069）和miR-15b（P=0.087）均下调或有下调趋势。(3)IUGR新生仔猪回肠中的miR-19a-3p有上升的趋势（P=0.071）、miR-19b显著上升(P＜0.05)、miR-181b显著下降(P＜0.05)。(4)IUGR新生仔猪回肠中Jagged1蛋白的表达显著高于(P＜0.05)NBW组。(5)miR-320与Jagged1基因可能存在靶向作用。总之，IUGR新生仔猪体内CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群数量和分布不平衡可能与Notch信号通路有关，且IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫功能受损可能与miRNA参与调节Notch2/Jagged1等信号通路关键因子的表达有关。　　4.三丁酸甘油酯对IUGR哺乳仔猪肠道黏膜免疫的调节作用　　试验选取8头NBW和16头IUGR新生仔猪，NBW仔猪为NBW组，IUGR仔猪分为IUGR组和IT组，每组8头仔猪。所有仔猪自然哺乳至7日龄断奶。7日龄至21日龄，NBW组和IUGR组饲喂基础奶粉日粮，IT组饲喂添加了0.1％三丁酸甘油酯的奶粉日粮。21日龄每组选6头仔猪屠宰取样。测定所有仔猪在0d、7d、10d、14d、17d和20d的体重，测定肠道消化酶活性、肠道绒毛形态、肠道黏膜免疫球蛋白水平、肠道IgG、FcRn和GPR41基因水平。结果表明，(1)IUGR和IT组仔猪的体重在0d、7d、1id和14d的时候都显著低于（P＜0.05）NBW组，但是在17d和20d时，IT组仔猪的体重显著高于IUGR组(P＜0.05)，且与NBW组差异不显著（P＞0.05）。(2) IUGR组仔猪的脾脏重显著低于(P＜0.05) NBW组，而IT组的脾脏重和相对脾脏重显著高于(P＜0.05)IUGR组。与NBW组相比，IUGR组仔猪的空肠更薄(P＜0.05)，十二指肠相对长度增加(P＜0.05)，IT组的空肠相对长度低于（P＜0.05）IUGR组，(3) IUGR组仔猪小肠绒毛长短不一， IT和NBW组仔猪小肠绒毛比较整齐。IUGR组仔猪小肠绒毛呈扁平状，更易受损，而IT和NBW组的小肠绒毛较完整且发育良好。(4) NBW组的绒毛长度最高，IT组次之，IUGR组最短;IT组的肌层厚度和黏膜厚度最高，NBW组次之，IUGR组最低。此外，三组仔猪十二指肠和空肠绒毛形态差异显著。(5)在十二指肠，IUGR组仔猪乳糖酶、蔗糖酶和脂肪酶活性低于(P＜0.05)NBW组，麦芽糖酶活性高于(P＜0.05) NBW组，而IT组仔猪乳糖酶活性显著高于(P＜0.05) IUGR组。在空肠，与NBW组仔猪相比，IUGR组仔猪胰蛋白酶活性降低（P＜0.05），蔗糖酶活性升高（P＜0.05）;而IT组仔猪胰蛋白酶活性高于(P＜0.05) IUGR组，蔗糖酶活性低于（P＜0.05）IUGR组。在回肠，IUGR仔猪5种消化酶活性均低于（P＜0.05）NBW组，IT组仔猪回肠这5种消化酶活性均高于(P＜0.05)IUGR组(6) IUGR仔猪回肠黏膜sIgA和IgG抗体的含量低于(P＜0.05) NBW组，而IT组仔猪回肠黏膜sIgA和IgG抗体的含量显著高于（P＜0.05）IUGR组。(7)IUGR仔猪十二指肠、空肠和回肠中IgG基因的表达量都低于（P＜0.05）NBW组，而IT组仔猪回肠中IgG的含量显著高于（P＜0.05）IUGR组。IUGR组仔猪十二指肠和回肠中GPR41基因表达量低于（P＜0.05）NBW组，而IT组仔猪十二指肠和回肠中GPR41基因表达量显著高于(P＜0.05)IUGR组。总之，三丁酸甘油酯可以提高IUGR哺乳仔猪的日增重、促进其肠道和免疫器官发育、改善肠道绒毛形态、提高肠道绒毛表面积和肠道内消化酶活性、提高肠道黏膜内抗体水平并促进IgG和GPR41基因的表达。　　5.丁酸钠和三丁酸甘油酯对IUGR断奶仔猪肠道黏膜免疫调节作用的比较　　试验选取8头NBW新生仔猪和24头IUGR新生仔猪。NBW仔猪为NBW组，来自与同一窝的3头IUGR仔猪被分别分到IUGR组、IS组（IUGR+0.05％丁酸钠）和IT组（IUGR+0.09％三丁酸甘油酯）。所有仔猪0到21d龄自然哺乳，21d龄断奶，NBW组和IUGR组饲喂基础日粮，IS饲喂丁酸钠日粮（基础日粮+0.05％丁酸钠），IT组饲喂三丁酸甘油酯日粮（基础日粮+0.09％三丁酸甘油酯），直至35d试验结束。测定所有仔猪在0d、21d、24d、27d、31d和35d的空腹体重、试验期仔猪腹泻率，计算每组每只仔猪平均日采食量、平均日增重和饲料利用率。每组选6头仔猪屠宰取样。测定仔猪免疫器官重、肠道长度和重量、肠道绒毛形态、肠道消化酶活性、肠道黏膜中免疫相关基因的表达。结果表明，(1) IUGR、IS和IT组仔猪体重0d、21d、24d和27d时都显著低于(P＜0.05) NBW组，但31d和34d时，IS组和IT组仔猪的体重与NBW组差异不显著（P＞0.05）。(2)IUGR组仔猪十二指肠重显著低于（P＜0.05）NBW组，相对空肠长度显著高于（P＜0.05）NBW组，IS组十二指肠重和相对空肠重均显著高于（P＜0.05）IUGR组，IT组的相对十二指肠重显著低于(P＜0.05)IS组。(3)IUGR组仔猪小肠绒毛形态指标均不如NBW组，饲喂丁酸钠或三丁酸甘油酯后，小肠绒毛形态有不同程度的改善。(4)总体趋势是，IUGR仔猪小肠消化酶活性低于NBW组，饲喂丁酸钠或三丁酸甘油酯后，消化酶活性有不同程度的提高。(5)IUGR组小肠黏膜一些部位CD4、CD8、FcRn、GPR41和IgG基因表达低于NBW组。IS组小肠黏膜一些部位CD4、CD8、MHC-Ⅱ、FcRn和IgG基因表达高于IUGR组，IT组小肠黏膜一些部位MHC-Ⅱ、FcRn、IgG和GPR41基因表达均高于(P＜0.05) IUGR组，IT组空肠和回肠CD4基因表达低于(P＜0.05)IS组，十二指肠IgG基因表达高于（P＜0.05）IS组，空肠IgG基因和十二指肠GPR41基因高于（P＜0.05）IS组。总之，在断奶时，给IUGR仔猪补饲丁酸钠或三丁酸甘油酯均可以从一定程度上提高其生长性能和增强其肠道黏膜免疫功能，且丁酸钠效果略优于三丁酸甘油酯。　　总之，通过以上五部分试验内容，我们研究了IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫的特性，发现其肠道黏膜免疫受损，肠道黏膜细胞因子分泌功能减弱;我们怀疑这与其肠黏膜内免疫细胞数量的减少，尤其是T淋巴细胞数量的减少有关，于是，进一步研究了IUGR新生仔猪体内中CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量和分布，发现IUGR新生仔猪体内T淋巴细胞亚群失衡，肠黏膜抗原递呈功能受损;于是，我们进一步探讨了其分子机制，研究了IUGR新生仔猪肠道内miRNA和Notch2/Jagged1信号通路关键因子的表达，筛选出了NBW和IUGR仔猪小肠中差异表达的miRNA，发现IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫功能受损可能与miRNA参与调节Notch2/Jagged1等信号通路关键因子的表达有关。最后，我们分别在哺乳期和断奶时对IUGR仔猪进行营养调控，发现哺乳期饲喂三丁酸甘油酯可以促进IUGR仔猪的追赶生长，提高其肠道黏膜免疫功能;断奶时给IUGR补饲丁酸钠或三丁酸甘油酯也可从一定程度上促进其生长，提高其肠黏膜免疫功能，且丁酸钠的效果略优于三丁酸甘油酯。

目录

声明

摘要

本文部分缩略词的中英文对照

引言

第一章 文献综述

第一节 IUGR在猪上的研究进展

1 IUGR的定义与发生

2 IUGR在猪上发生的原因

3 IUGR对猪的影响

4 IUGR猪的营养调控

5 IUGR猪的相关机理研究

6 IUGR猪未来研究展望

第二节 仔猪肠道黏膜免疫

1 仔猪肠道黏膜免疫的定义与特点

2 仔猪肠道黏膜屏障

3 仔猪肠道黏膜免疫机制

第三节 丁酸及其衍生物在仔猪上的应用

1 丁酸及其衍生物的结构和功能

2 仔猪肠道生理特点

3 丁酸及其衍生物在仔猪上的应用

第二章 IUGR新生仔猪肠道黏膜免疫特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

第三章 IUGR新生仔猪肠道CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量和分布

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

第四章 IUGR新生仔猪肠道miRNA和Notch2／Jaggedl信号通路关键因子的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 本章小结

第五章 三丁酸甘油酯对IUGR哺乳仔猪肠道黏膜免疫的调节作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

第六章 丁酸钠和三丁酸甘油酯对IUGR断奶仔猪肠道黏膜免疫的调节作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

本文创新点与有待进一步研究的问题

致谢

攻读博士学位间论文发表