普通小麦及其近缘种LMW-GS的鉴定、编码基因克隆与进化分析

摘要

小麦贮藏蛋白是影响小麦品质的主要蛋白，主要包括醇溶蛋白和谷蛋白。谷蛋白主要由高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)组成。HMW-GS与LMW-GS的含量及组成可直接影响小麦面粉的加工品质。本研究以普通小麦及其近缘种为材料，利用SDS-PAGE技术通过对它们中LMW-GS的分离和鉴定，设计等位基因特异PCR(AS-PCR)引物，对其编码基因进行分子克隆、序列测定与分析，预测LMW-GS的二级结构特征，分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系。为利用基因工程改良小麦品质提供参考依据，为进一步探讨小麦起源与进化奠定基础。 1．普通小麦及其近缘种中LMW-GS的分离鉴定和基因克隆 用SDS-PAGE对16份普通小麦及其近缘种材料的LMW-GS进行分离鉴定。结果表明，LMW-GS、在SDS-PAGE图谱上主要分为B亚基和C亚基两大区域，D亚基在部分品种中存在。 根据LMW-GS编码基因5’和3’端的保守序列，设计了5对特异性引物，分别以面包小麦(Acbalne和Trenton)、野生二粒小麦(Y19和Y21)、栽培一粒小麦(U7)、卵穗山羊草(P1287737、P1361880、P1573408、P1574475和P1573409)、高大山羊草(P1604122、P1604110 和 P1604108)和茹可夫斯基小麦 (P1352553、P1355706 和P1355707) 的基因组DNA为模板进行扩增，均获得了较明显的扩增条带，然后分别回收并克隆到T-Easy载体上，测序后得到23个新LMW-GS基因，已分别命名并登录GenBank。 2．普通小麦及其近缘种LMW-GS基因的序列特征分析 基因TreLMW-m1 和基因TmLMW-i1 (部分序列)包括上下游及开放阅读框，基因序列全长分别为1509bp和1274bp。上游序列中存在一些LMW-GS基因的较保守的特征序列，有TATA框，CAAT框和胚乳框，它们对基因表达有着重要的作用。基因TreLMW-m1 上游为386bp，有两个TATA框，分别在-76到-71，-59到-54两个位置上。 TmLMW-i1基因(部分序列)上游为375bp，有两个TATA框，分别在-79到-74，-62到-57两个位置上，二者均有一个CAAT框在-10到-6的位置上。一个胚乳框在基因的-305到-279位置上，序列为ACATGTAAAGTTAAT AAGGTGAGTCAT。基因TreLMW-m1和基因TmLMW-i1(部分序列)的下游序列长度均为193bp，保守位置上含有序列为AAATAAA的多腺苷酸化信号，均分别位于终止密码子下游72到77，130到136，141到147这三个位置上。基因TdLMW-m1、TzLMW-m2、AlLMW-m2、TzLMW-m1、AlLMW-m4、TreLMW-m1、AgLMW-m1、AgLMW-m2、AgLMW-m3、AgLMW-m4、AgLMW-m5、AgLMW-m6的编码区大小分别为1056bp、1056bp、1050bp、843bp、846bp、927bp、906bp、903bp、903bp、903bp、912bp、903bp，其中TdLMW-m1、TzLMW-m2、AlLMW-m2、AlLMW-m1、TreLMW-m1、AgLMW-m1、AgLMW-m2、AgLMW-m6、AgLMW-m3、AgLMW-m4都由两个连续终止密码子TGA和TAA终止编码，分别编码350个、350个、348个、280个、307个、300个、299个、299个、299个和299个氨基酸，TzLMW-m1、AgLMW-m5分别由一个终止密码子TGA终止编码，各编码280个、303个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列，计算出成熟蛋白质的分子量，分别为37.8KD、37.7KD、37.4KD、31.8KD、31.8KD、32.8KD、31.7KD、31.6KD、31.8KD、31.6KD、31.9KD、31.8KD。因此推测这12个基因编码的蛋白质均为C亚基。通过序列特征分析，它们均为LMW-m型。基因AgLMW-i1的编码区为954bp，由两个连续的终止密码子TGA及TAA终止编码，编码316个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列，计算出成熟蛋白质的分子量为34.2KD。因此推测这个基因编码的蛋白质为C亚基。通过序列特征分析，它为LMW-i型。其中AgLMW-i1具有Ⅰ型、含有9个半胱氨酸残基、含有一条连续27个Q的寡聚谷氨酰胺链等特征，与小麦加工品质正相关，可能为候选的优质基因。由于在连入T-Easy载体的过程中，基因内部序列部分丢失，基因TmLMW-i1编码区内只获得了部分序列。通过序列特征分析，它为LMW-i型。基因AcLMW-s1编码区大小为1074bp，由两个连续TAA终止密码子终止编码，编码356个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列，计算出成熟蛋白质分子量为38.3KD，因此推测此基因编码的蛋白质为C亚基。通过序列特征分析，它为LMW-s型。基因pAILMW-i1、pTzLMW-i1、pTzLMW-i2、pAgLMW-m1、pAgLMW-i1、pAgLMW-i2、pTreLMW-i1和pTmLMW-m1的编码区内部都有终止密码子，导致了这些基因不能表达，为沉默基因。 3.LMW-GS基因编码蛋白的序列比对 利用Bioedit软件将所克隆的新基因与从GenBank中调取的基因进行多序列比对分析。将12个LMW-m型基因分开为3个部分，分别与GenBank中的9个LMW-m型基因进行比对。将1个LMW-i型基因与GenBank中的9个LMW-i型基因进行比对。将1个LMW-s型基因与GenBank中的10个LMW-s型基因进行比对。序列比对结果表明，每一类型的基因与其同类型的基因具有较大的序列相似性。除了基因AgLMW-i1、AgLMW-m6编码的蛋白分别在Ⅳ区的第47位和III区的第63位上多出一个半胱氨酸残基外，其余基因编码的蛋白均具有8个半胱氨酸残基。我们推测，这个额外半胱氨酸残基的出现，可能增加分子间二硫键数目，使面团粘弹性增加。因此，推测克隆的这2个新基因可能和小麦的优良品质相关。基因TdLMW-m1、TzLMW-m2和AlLMW-m2所推导出的氨基酸序列在重复区含有大量的氨基酸的插入或替换，一个长的N-端重复区对小麦面粉的品质也有积极作用。因此，我们推测克隆的这3个新基因可能和小麦的优良品质相关。 4．LMW-GS的二级结构预测 本研究采用 PSIPRED2.0 二级结构预测方法，预测结果显示，AlLMW-m2、TdLMW-m1 和 AgLMW-i1 的B-折叠含量较高，进一步说明了它们可能为候选的优质基因。 5．LMW-GS基因的遗传进化关系 进化树分析表明：Ⅰ型基因明显比另外两种基因分离出来得早，而LMW-s基因和LMW-m基因相对亲缘关系较近。分化时间计算表明：LMW-i型基因大约在15.22百万年前就与LMW-m和LMW-s位点分离开来， LMW-m和LMW-s型基因编码位点的分离则大约发生在9.149百万年前。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图和附表清单、文中缩写中英文对照

1.文献综述

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2 LMW-GS的分离

2.2.1仪器设备

2.2.2蛋白质提取

2.2.3 SDS-PAGE

2.3 LMW-GS编码基因的分子克隆

2.3.1仪器设备

2.3.2小麦种子基因组DNA提取

2.3.3 PCR基因扩增

2.3.4 T-Vecter基因克隆

2.3.5基因序列比较与分析

3.结果与分析

3.1普通小麦及其近缘种LMW-GS的鉴定、编码基因克隆与测序

3.1.1 LMW-GS的SDS-PAGE鉴定

3.1.2 LMW-GS基因的PCR克隆与测序

3.2 LMW-GS新克隆基因及其编码蛋白的序列特征分析

3.2.1 LMW-GS序列的上下游特征分析

3.2.2 LMW-m型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析

3.2.3 LMW-i型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析

3.2.4 LMW-s型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析

3.2.5普通小麦及其近缘种LMW-GS沉默基因的序列特征分析

3.3 LMW-GS新克隆基因及其编码蛋白的序列比较分析

3.3.1两个新基因与其他已登录基因的上游序列比对

3.3.2 LMW-m型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析

3.3.3 LMW-i型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析

3.3.4 LMW-s型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析

3.4 LMW-GS新克隆基因编码蛋白的二级结构预测

3.5 LMW-GS基因的系统进化分析

4.讨论

5.结论

参考文献

附录：氨基酸中英文名及简写对应表

致谢

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