猪高热病细菌性病原的分离鉴定及其生物学特性研究

摘要

猪“高热病”是由多种病原混合感染引起的综合征，针对安徽地区猪群中广泛流行的多病因“高热病”进行细菌性病原的研究对“高热病”的防治具有重要的现实意义。
　　 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）形态学、生长特性相似，临床感染难以区分，本研究根据HPS、Pm、APP的特异性序列，成功建立了复合PCR方法的快速诊断方法，该方法特异性好，可以检测出HPS、Pm、APP最低量分别为60pg、120pg和50 pg的DNA，极大的提高了三种细菌的鉴定速度和效率，同时将该方法应用于病死猪的病料检测，结果显示该方法可用于HPS、Pm、APP的临床监测。
　　 利用常规细菌分离鉴定结合建立的复合PCR方法，从安徽肥东、肥西、淮北、桐城、阜阳、宿州、六安、庐江、宣城、舒城十个地区的具有高热及呼吸系统症状的146头发病或死亡猪中分离细菌67株，分离率为45.89％，其中SS20株，HPS12株，Pm16株，APP2株，分离率分别为29.85％；17.91％；23.88％；2.98％，初步了解到安徽地区的规模化猪场及散养户中广泛存在的细菌感染情况。对16分离株Pm进行血清型鉴定发现12株为荚膜A型，占总数的75％，表明A型Pm是当前安徽地区Pm的主要流行血清型；利用特异性引物对20株分离的SS进行鉴定发现5株为2型猪链球菌，阳性率25％；对安徽分离的12株HPS进行了PCR-RFLP基因型的鉴定，12株HPS可分成5种不同的基因型；生长特性表明2株APP均为生物Ⅰ型；药敏试验结果表明4种分离菌对14种抗菌素的敏感性不同，但都对氟苯尼考、头孢噻肟、阿莫西林和环丙沙星敏感，这四种药物可用于临床防治。
　　 对安徽省HPS分离株转铁蛋白结合蛋白（tbpA）基因进行扩增和序列测定，根据序列同源性建立系统发生树，并与RFLP分型结果进行比较，发现相同基因型的分离株在相同或相近的进化关系上；对分离株HPS进行动物感染试验，相同RFLP型的分离菌致病性一致，表明tbpA是影响HPS致病性的重要因素。
　　 总之，本研究针对安徽地区猪“高热病”中细菌性病原分离鉴定、优势血清型及药物敏感性的研究对猪“高热病”的防治具有理论的指导意义；对tbpA与HPS致病性的关系研究，为安徽地区猪“高热病”及细菌性病原的深入研究提供了基础资料。

目录

文摘

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声明

文献综述

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.1.1病料来源

2.1.2参考菌株

2.1.3主要培养基

2.1.4主要试剂与溶液配制

2.1.5细菌微量生化反应管

2.1.6抗生素药敏试验纸片 购于杭州天和微生物试剂有限公司

2.1.7引物设计

2.1.8主要仪器

2.2细菌的分离培养与生化鉴定

2.2.1培养基的制备

2.2.2细菌的分离培养

2.2.3生化试验鉴定

2.3 HPS、Pm、APP复合PCR方法的建立与应用

2.3.1细菌DNA的提取

2.3.2病料中细菌DNA提取

2.3.3 PCR扩增

2.3.4复合PCR反应条件优化方案

2.3.5 PCR产物分析

2.3.6复合PCR的特异性测定

2.3.7复合PCR的敏感性

2.3.8复合PCR的临床应用

2.4 A型Pm的鉴定

2.4.1 DNA模板的制备

2.4.2 A型Pm的PCR鉴定

2.4.3 PCR产物分析

2.5 SS2的PCR鉴定

2.6分离株HPS部分生物学特性研究

2.6.1 HPS形态多样性

2.6.2 HPS卫星现象

2.6.3 HPS生长曲线的测定

2.6.4 HPS 16srRNA序列测定与分析

2.6.5 HPS动物感染试验

2.7副猪嗜血杆菌tbpA RFLP型与序列分析

2.7.1 tbpA的扩增

2.7.2 tbpA-RFLP型鉴定

2.7.3 tbpA基因的克隆与分析

2.8 HPS、Pm、APP、SS药物敏感试验

3结果

3.1 HPS、Pm、APP、SS的分离培养与生化鉴定

3.1.1 HPS的分离培养与生化鉴定

3.1.2 Pm的分离培养与生化鉴定

3.1.3 APP的分离培养与生化鉴定

3.1.4链球菌的分离培养与生化鉴定

3.2 HPS、Pm、APP复合PCR方法的建立与应用

3.2.1 HPS、Pm、APP复合PCR体系的优化

3.2.2复合PCR方法的特异性

3.2.3复合PCR的敏感性

3.2.4复合PCR的临床应用

3.3 A型Pm的PCR鉴定结果

3.4 SS2的PCR鉴定结果

3.5分离株HPS部分生物学特性研究

3.5.1 HPS多形态性观察

3.5.2 HPS卫星现象

3.5.3 HPS生长曲线

3.5.4 HPS分离株16srRNA序列扩增与测定

3.5.5 HPS动物感染试验

3.6 HPS tbpA PCR-RFLP分型与tbpA序列分析

3.6.1分离菌tbpA的扩增

3.6.2 tbp A的RFLP分型

3.6.3 HPS tbpA基因序列分析

3.7 HPS、Pm、APP、SS的药物敏感试验

4讨论与分析

4.1建立复合PCR快速检测方法对HPS、Pm、APP感染的临床意义

4.2安徽省部分地区猪“高热病”中细菌感染情况及其优势血清型/基因型

4.3 HPS致病力的影响因素

4.4 HPS、Pm、APP、SS分离株药物感受性

结论

参考文献

致谢

附录

个人简介、研究生期间发表的论文